材料和试剂

1000μl移液管吸头（Thermo Fisher Scientific，Fisherbrand ^TM，目录号：02-681-4）
50ml的锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，Fisherbrand ^{，目录号：06-443-20）}
1.5ml微量离心管（Thermo Fisher Scientific，Fisherbrand ^TM，目录号：05-408-129）
方形（100×100×15mm）培养皿（Thermo Fisher Scientific，Fisherbrand ^{TM，目录号：08-757-11A）}
圆形（35mm）培养皿（VWR International，目录号：10799-192）
微孔胶带1530-0（3M，目录号：70200412230）
铝箔
剃刀刀片
矩形（24×50mm）显微镜盖玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-544E）
贴上标签
> 4毫升玻璃香水喷雾瓶（可在工艺品店购买）
用热休克构建体转化的拟南芥 Columbia-0（Col）种子（Guseman等人，2015; Moss等人，2015年，）
Bacto琼脂（BD，目录号：214010）
Linsmaier-Skoog Media（Caisson Laboratories，目录号：LSP03-1LT）（见注1）
Triton X-100（GE Healthcare，目录号：US22686）
吲哚-3-乙酸（IAA）（bioWORLD，目录号：705490）
卡那霉素（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP906-5）
95％乙醇
种子灭菌溶液（见配方）
0.5x Linsmaier-Skoog（LS）液体培养基（参见配方）
无菌电镀琼脂溶液（见配方）
0.5x LS培养基+ 0.8％琼脂（参见配方）
盖玻片介质（0.5x LS培养基+ 1.2％琼脂）（参见配方）
IAA储备溶液（5mM）（参见配方）

设备

载玻片加热器（Thermo Fisher Scientific，型号：11-474-470）
配有Lumencor SOLA光源和YFP过滤器立方体的显微镜（Leica Biosystems，型号：DMI 3000B）
Leica长工作40x HCX PL FLUOTAR物镜（见注2）
Leica相机（Leica Microsystems，型号：DFC345 FX）
钳（电子显微镜科学，型号：Dumont Tweezers Style 2A）
定时器

软件

Leica LAS AF版本2.6.0用于图像采集
用于图像分析的Fiji/ImageJ软件
GraphPad Prism6软件包用于绘图和统计分析

程序

注意：Aux/IAA蛋白的表达水平通常非常低，因此我们已经修饰了现有的热休克诱导启动子系统（Gray等人，2001）以产生高水平的荧光标记的Aux/IAA用于在激素治疗之前的根组织中的活细胞成像

产生转基因拟南芥植物
1. 如前所述克隆热激诱导的VENUS标记的Aux/IAA构建体（HS :: VENUS-IAA-NLS）（Guseman等人，2015; Moss等人，2015），并基于含有大豆热休克启动子HS6871的pGREEN载体（Gray等人，2001）。
2. 使用花浸渍法（Clough和Bent，1998）用这些构建体转化拟南芥植物。然后将植物在含有50mg/ml卡那霉素的0.5x LS琼脂平板上选择两代，以获得T2系。对于下述实验，应使用每个构建体2-3个独立的T2系（见注释3-5）
电镀和生长苗
注意：以下步骤B1-4应在无菌条件下在无菌罩中进行。
1. 在无菌罩中将0.5x LS + 0.8％琼脂倒入方形培养皿中。每个实验每个独立植物系列倒1板。
2. 等分约30种子到1.5ml管中，加入300μl种子灭菌溶液。在其侧面设置管，以确保所有种子都与溶液接触。让静置15分钟，然后取出灭菌溶液，并更换为95％乙醇。反转几次洗。使用移液管完全删除95％乙醇，并更换无菌电镀琼脂溶液。一定要将非荧光兄弟姐妹（或其他非荧光线）作为对照
3. 使用1000微升移液器吸头轻轻地吸取种子，并转移到0.5x LS板。对于每个独立的系，将板平板成每板12个植物的2排（图1A）。用微孔带或石蜡膜密封板。
4. 在4℃在黑暗中（用铝箔覆盖）垂直地将幼苗分层2天。
5. 在设置在16L：8D光照条件下和20℃下的生长室中垂直生长7天。
热冲击感应
1. 生长7天后，将板水平放置在37℃的载玻片加热器上2小时以诱导VENUS-IAA蛋白的表达（图1B和2A）。
  
  图1.热休克降解测定的实验设置和分析 A.将7天龄的幼苗播种在正方形的垂直生长的0.5x LS + 0.8％琼脂平板上。 B.苗木板在载玻片加热器上经受热休克。 C.用实验室胶带包裹的盖玻片以适合载玻片架。 D.使用小培养皿从盖玻片培养基琼脂上切下圆盘。 E.修剪光盘边缘，使其均匀地贴合在盖玻片上。 F.含有0.5x LS培养基与乙醇或5μMIAA的香水瓶。 G.琼脂垫与幼苗排列在上面。 H.将盖片置于琼脂垫顶部并翻转。 I.将盖片放置在显微镜载片架中。 J.载玻片架中琼脂植物盖玻片的特写图像
生长素诱导的VENUS-Aux/IAA降解测定
1. 制备0.5x LS培养基+ 1.2％琼脂盖玻片培养基。这种琼脂浓度是关键的，因为它是刚性足以处理，但足够低的浓度，以减少荧光成像期间背景自身荧光。
2. 在无菌罩中倒入4个板，将IAA加入2个板中，并将乙醇（模拟）加入2个板中。为此，将50ml培养基倒入无菌的50ml管中，加入50μl5mM IAA或95％乙醇。通过温和倒置混合并倒入两个正方形板中。
3. 准备一个矩形24 x 50毫米盖玻片适合显微镜载玻片支架。每端缠绕实验室胶带约3次，以增加长度，以便盖玻片将紧贴在支架（图1C）。这些薄盖玻片容易破碎，所以一定要轻轻处理。
4. 当盖玻片培养基板是固体时，使用35mm圆形培养皿将圆切成琼脂（图1D）。使用剃刀刀片进一步切割圆，使琼脂切片适合盖玻片和植物（图1E）。虽然用小培养皿切割圆不是必要的，但我们发现这种方式切割的琼脂切片更容易从板上去除。或者，使用剃刀刀片切割切片，并小心地将其从板上提起
5. 准备5微米IAA或模拟处理，以喷洒到幼苗。吸管4毫升液体0.5x LSinto两个干净的5毫升香水瓶（图1F）。添加4微升的95％乙醇（模拟）或5毫米IAA储备液到香水瓶。保持香水瓶清洁，用乙醇洗涤，然后用水和LS冲洗。保存单独的，标记瓶的模拟和IAA解决方案。
6. 使用镊子，将5-6个幼苗从板式加热器转移到单独的琼脂板（使用额外的非补充植物生长板）。用含有5μMIAA或载体（95％乙醇）的液体0.5x LS喷雾。使用足够的液体以完全覆盖根尖。
7. 使用镊子，迅速安排这些幼苗到琼脂块（在步骤D4中制备）包含适当处理（模拟或5μMIAA）（图1G）。将盖玻片放在夹住幼苗的琼脂块上（图1H）。小心避免根尖附近的气泡。将琼脂 - 植物 - 盖玻片翻转并放置在载玻片保持器中以进行成像（图11I-J）。
8. 在处理后0,10,20,30,40和60分钟的图像植物根尖（图2B）。重要的是尽量减少样品制备和成像之间的时间，以及保持样品之间的一致性。我们使用装有Leica longworking 40x HCX PL FLUOTAR物镜（见注2）的Leica DMI 3000B显微镜，用Lumencor SOLA光源和YFP滤光立方体照明。使用Leica LAS AF版本2.6.0软件和Leica DFC345 FX照相机捕获图像。重要的是对具有相同强度和增益设置的所有植物成像。我们使用1秒曝光和3.6增益。基于显微镜系统和特定荧光团，每个实验室可能需要确定理想的曝光和增益设置。重要的是注意可能发生光漂白。在我们的实验中，我们使用单独用VENUS（没有融合的IAA蛋白）的对照线以及模拟处理的VENUS-IAA细胞系来测试和记录在成像上发生的光漂白的程度时间过程（Guseman等人，2015; Moss等人，2015）。
  
  <图>图2.生长素诱导的VENUS-Aux/IAA降解（A）和生长素或模拟处理后的代表性荧光根尖图像（B）的示意图
荧光定量和分析
1. 使用Fiji软件，打开图像文件，确保未在初始弹出窗口的左下角选中"自动缩放"。图像将初始显示为黑色。单个植物的图像应该排列成一叠时间点（图3A-B）。使用图像>将所有图像设置为相同的亮度/对比度。调整>亮度/对比度功能，然后检查"传播到所有其他打开的图像"框。我们分别使用最小和最大值500和2,200（图3C）。
2. 使用框工具，创建感兴趣的根尖区域大小的框（图3D）。使用编辑>旋转框以适应。选择>旋转功能，然后将框移动到感兴趣的区域上（图3D）。按"M"按钮测量像素亮度。确保在分析>下选中"平均灰度值"。设置测量。通过打开Analyze>保存感兴趣区域框工具> ROI管理器，并使用此相同的框在堆叠中的所有其他图像上重复测量。对于下一个堆叠，您可能需要旋转框以适应新的根角，并且您可以将这个新的有角框保存在ROI管理器中。
  
  图3.使用斐济软件进行的热休克降解测定分析。A.来自单个实验的代表每个植物的图像文件堆栈。 B.每个堆栈包含表示每个时间点的6个图像。 C.对话框显示斐济的亮度/对比度设置。 D. ROI框绘制为横向根图像的宽度和长度，ROI框旋转以适合根图像的荧光部分，并旋转ROI框定位待测量的根尖区域。
3. 使用非荧光兄弟姐妹（或其他非荧光线）来计算背景水平。
4. 从"测量"框中复制像素亮度，并粘贴到电子表格文件中。标记每行，处理和时间点。这是原始数据。
5. 对于每一行，在每个时间点计算来自所有非荧光植物的背景荧光的平均值（可能为2-3（参见注3））。在新柱中，从每个实验植物的时间点匹配荧光值中减去该背景荧光值（即，对于荧光植物，从时间点T0的平均背景荧光将从所有T0值中减去））。发现T0值低于350AU的个体植物在噪声范围内，并从数据集中移除。绘制每条线和复制品的平均背景扣除数据（图4A，左图）说明在品系和重复品之间观察到的基础荧光的变异性。
6. 接下来，通过除以初始荧光值（即，初始归一化倍数）来归一化每个堆叠/植物内的每个时间点的荧光。绘制每条线和重复的平均归一化数据使得能够更好地比较线和重复（图4A，右）。少数品系与具有相同基因型的其他品系的表现显着不同（例如，，荧光高得多，并且对生长素处理没有反应），可能是由于位置效应或T- DNA。这些行从分析中删除。
7. 最后，绘制来自所有线和重复的所有个体的平均的折叠初始荧光值。实施例图（图4B）显示了VENUS-IAA1和VENUS-IAA28之间生长素诱导的降解动力学的差异。
  
  图4.在生长素或模拟处理后VENUS-Aux/IAA降解的代表性定量。A.三个独立的VENUS-IAA1品系的背景扣除荧光测量。数据未在左图中标准化，并且在右图中进行倍数初始归一化。每个数据点表示通过重复实验进行的5-6株植物的平均荧光，误差条表示平均值的标准误差。 B. IAA1-VENUS和IAA28-VENUS的折叠初始标准化数据，包括来自2-3个独立系的至少两个重复的多个植物。误差线表示平均值的标准误差。

笔记

我们使用LS培养基进行我们的所有实验。我们还没有尝试这些实验与MS媒体;然而，我们假设可能MS可以用来代替LS。
我们使用的显微镜??是一个40x长工作距离（LWD）物镜的倒置镜。 LWD目标不是必需的，但是40x的目标将工作最好。此外，如果使用的范围不是倒置的，琼脂 - 植物 - 盖玻片可以直立地放置在载玻片上用于成像。
我们使用分离的T2HS :: IAA-VENUS品系，其包括对于T-DNA是半和纯合的植物以及非发荧光的植物。与这种混合的基因型群体一致，我们确实观察到在我们的原始数据中绝对荧光强度的一些变异性。折叠初始归一化校正了这种变异性，并揭示了每行内同样的退化趋势。我们使用非荧光兄弟姐妹来计算背景荧光。如果您想使用纯合T3系，您还需要平行培养非荧光植物，每次实验使用2-3个背景荧光测量。
为了进一步确认转基因植物的基因型，可以从每个幼苗分离基因组DNA（来自2-3周龄幼苗的小叶或两个应足够），并使用引物扩增转基因进行基因分型PCR。例如，我们使用结合HS启动子区的正向引物和结合特异性Aux/IAA序列的反向引物。
要测试每条线的植物数量将取决于您在线内看到的变化。有些行变化更大。一般来说，我们每个实验处理5-6株植物/株，并重复实验至少两次。

食谱

种子灭菌溶液
35ml的100％乙醇 25μl100％Triton X-100 用无菌水填充至50ml 反转几次混合
0.5x Linsmaier-Skoog（LS）液体培养基
向带搅拌棒的烧杯中加入1,800ml水。在搅拌的同时，向水中加入1L LS包。一旦溶解，用水带来体积高达2升。将500ml每个倒入单独的1L玻璃瓶中并高压灭菌（121℃）20分钟。
立即使用剩余的溶液制备琼脂培养基（见下文）。
无菌电镀琼脂溶液
0.1％细菌琼脂在无菌水中的溶液高压灭菌（121℃）20分钟
0.5x LS培养基+ 0.8％琼脂
从上面剩余的培养基中，将500ml倒入两个单独的1L玻璃瓶中的每一个中。向每个瓶（= 0.8％琼脂）和高压灭菌（121℃）中加入4g琼脂20分钟
盖玻片介质（0.5×LS培养基+ 1.2％琼脂）
将剩余的500ml 0.5×LS液体培养基倒入1L玻璃瓶中。加入6g琼脂（= 1.2％琼脂）和高压灭菌（121℃）20分钟。
IAA储备溶液（5mM）首先制备100mM储备溶液：
8.76mg吲哚-3-乙酸（IAA，MW：175.18） 500μl95％乙醇
用95％乙醇稀释100mM储备液以制备5mM溶液。这些储备应储存在-20℃的黑暗中。

致谢

此协议改编自Gray等人。（2001），并且由Guseman等人进行。（2015）和Moss等人。（2015）。这项工作得到了Paul G. Allen家庭基金会（J.L.N.），国家科学基金会（MCB-1411949至J.L.N.）和国立卫生研究所（R01-GM107084至J.L.N.）的支持。 B. L. M.从国立卫生研究院的国家癌症研究所（F32CA180514）获得了奖学金支持。 J.M.G.得到国家儿童健康和人类发展研究所（NICHD）的发育生物学预发性训练补助金[T32HD007183]的支持。作者感谢Jodi LS Lilley仔细阅读这份手稿。

参考文献

Clough，SJ和Bent，AF（1998）。 Floral dip：农杆菌介导的拟南芥转化的简化方法。植物J16（6）：735-743。
Gray，WM，Kepinski，S.，Rouse，D.，Leyser，O.and Estelle，M。（2001）。生长素调节AUX/IAA蛋白的SCF（TIR1）依赖性降解。
414（6861）：271-276 。

Gasseman，JM，Hellmuth，A.，Lanctot，A.，Feldman，TP，Moss，BL，Klavins，E.，Calderon Villalobos，LI and Nemhauser，JL（2015）。生长素诱导的降解动力学设定侧根发育的速度。发育 em> 142（5）：905-909。

Havens，KA，Guseman，JM，Jang，SS，Pierre-Jerome，E.，Bolten，N.，Klavins，E.and Nemhauser，JL（2012）。合成方法揭示了生长素信号的广泛可调性。植物生理学 160（1 ）：135-142。

Korasick，DA，Jez，JM和Strader，LC（2015）。通过结构生物学优化核生长素应答途径。 Curr Opin Plant Biol 27：22-28。

Moss，BL，Mao，H.，Guseman，JM，Hinds，TR，Hellmuth，A.，Kovenock，M.，Noorassa，A.，Lanctot，A.，Villalobos，LI，Zheng，N.and Nemhauser，JL 2015）。 Rate motifs tune auxin/indole-3-乙酸降解动力学。植物生理学 169（1）：803-813

Purvis，JE和Lahav，G。（2013）。通过信号动力学对细胞信息进行编码和解码。 152（5）：945-956。