材料和试剂

包装膜（Fisher Scientific，Parafilm M ，目录号：S37440）
微量离心管（1.7ml）（Fisher Scientific，目录号：14-222-171）
无菌塑料培养管（Fisher Scientific，目录号：14-956-6A）
Costar 3524平板（24孔组织培养处理的）（Fisher Scientific，Corning，TM Costar，sup。TM，目录号：07-200-84）
Costar 3904板（96孔黑色组织培养处理）（Fisher Scientific，Corning公司，目录号：07-200-588）
150-ml Nalgene无菌一次性0.2μm过滤单元（Fisher Scientific，Thermo Scientific Nalgene TM ，目录号：09-741-01）
500-ml Nalgene无菌一次性0.2μm过滤单元（Fisher Scientific，Thermo Scientific Nalgene TM，目录号：09-741-02）
金黄色葡萄球菌储存培养物，在-80℃下在25％（v/v）无菌甘油中储存。
甘油（Fisher Scientific，目录号：G33-1）
胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）板（BD，BBL TM ，目录号：221283）
胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）（BD，Difco TM ，目录号：211825）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271-1）
右旋糖（Fisher Scientific，目录号：D16-500）
4-氨基-5-甲基氨基-2'，7'-二氟荧光素二乙酸酯（DAF-FM二乙酸酯）（Thermo Fisher Scientific，目录号：D-23842）
二甲基亚砜（DMSO）（100ml）（Sigma-Aldrich，目录号：276855）
人血浆，冻干（5ml）（Sigma-Aldrich，目录号：P9523）
碳酸盐 - 碳酸氢盐缓冲液胶囊（Sigma-Aldrich，目录号：C3041）
含有钙和镁的1×Hank's缓冲盐溶液（HBSS）缓冲液（Fisher Scientific，Corning公司，目录号：MT21023CV）
二乙胺（DEA）（100ml）（Sigma-Aldrich，目录号：471216）
二乙胺NONOate（DEA/NO）（10mg小瓶）（Cayman Chemicals，目录号：82100）
（cPTIO）（5mg小瓶）（Cayman Chemicals，Inc。），将2-（4-羧基苯基）-4,5-二氢-4,4,5,5-四甲基-1H-咪唑基-1-氧-3-氧化物，单钾盐目录号：81540）
无菌无核酸酶H 2 O（Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9930）
NaOH（Thermo Fisher Scientific，目录号：S318-500）
50％（v/v）甘油储备溶液（见配方）
生物膜介质（参见配方）
碳酸盐 - 碳酸氢盐缓冲液（参见配方）
20％人血浆（见配方）
DAF-FM二乙酸酯储备溶液（见配方）
0.01 M NaOH溶液（见配方）
DEA/NO储备溶液（见配方）
cPTIO储备溶液（见配方）
DAF-FM二乙酸酯工作溶液（参见配方）
DEA/NO工作解决方案（参见配方）
DEA工作解决方案（参见配方）

设备

多检测酶标仪（Biotek synergy HT，型号：SIAFR）
10S Bio UV/Vis分光光度计（Thermo Fisher Scientific，GENESYS TM ，型号：840-208100）
平板培养箱（VWR International，目录号：97058-224，型号：1556）
摇动培养箱（VWR International，Signature TM ，目录号：14004-300，型号：1570）
Pipet-Lite XLS +单通道移液器（2-20μl，20-200μl，100-1,000μl）（Rainin，目录号：17014406）
将Rack LTS吸头（"P20"2-20μl，"P200"20-200μl，"P1000"100-1000μl）（Rainin，Green-Pak TM sups和SpaceSaver TM sup- sup>，目录号：17001865,17001863和17001864）
Labconco II类A2生物安全柜（Fisher Scientific，Labconco< sup> TM< sup> TM Logic + TM ，目录号：30-238-1100） >
涡旋混合器（Fisher Scientific，Fisher Scientific ，目录号：02-215-365）
微型离心机（Fisher Scientific，Fisher Scientific accuSpin TM ，目录号：13-100-675）
化学烟气罩
冰箱（4°C）
冷冻（-20°C）
冷冻（-80℃）

程序

整个实验的一般安全说明：
a。当使用BSL-2生物体如金黄色葡萄球菌时，所有潜在的气溶胶产生步骤应在II类A2生物安全柜中进行，以确保用户安全。在每个步骤旁边放置一个星号（*），应在生物安全柜中进行，以保持无菌技术和用户安全。
请注意，虽然在视频1-4中展示的演示在实验室工作台上拍摄（以便于清晰的视频摄影），但在使用BSL-2时，这些步骤应在II类A2生物安全柜下进行菌。
c。同样，在开始本实验之前，应仔细阅读DEA/NO，DEA和DMSO（可从制造商在线获取）的MSDS表，并采取建议的安全预防措施，以避免皮肤接触和呼吸吸入每种化学品都需要。因此，在化学通风橱内进行适当的化学操作。此外，为协议的所有步骤佩戴实验室外套，护目镜和丁腈手套，以符合生物安全和化学品安全考虑。

第1天：

*划线用于从冷冻甘油储液分离的TSA板。金黄色葡萄球菌。在平板孵育器中在37℃孵育24小时。在本实施例方案中，使用临床甲氧西林敏感菌株UAMS-1（Gillaspy等人，1995）。

第2天：
*使用单个 S。金黄色葡萄球菌（来自步骤1中的TSA平板）以在无菌塑料培养管中接种3ml生物膜培养基。在振荡培养箱中在37℃，250rpm生长16小时。
*向4孔Costar 24孔组织培养板中加入350μl20％（v/v）人血浆溶液。用包装膜将盖子盖在板上，并在4℃下保存，直到第3天使用。

第3天：
从4℃取出24孔板，平衡至室温
测定在无菌TSB中20倍稀释的600nm处的光密度（OD 600）。 aureus 过夜培养物。使用无菌TSB作为分光光度计的空白对照。将该读数乘以20以计算过夜培养物的实际OD 600/ml/ml。
计算使用多少过夜培养物接种1ml生物膜培养基至最终OD 600/ml = 0.05。根据计划接种的生物膜孔的数量，根据需要放大体积，并添加1ml以解决移液误差（在该特定的样品方案中，将接种3个生物膜孔，因此4ml的含有稀释的生物膜培养基过夜培养）。
使用P1000移液管，小心地从24孔板的每个孔中取出所有血浆溶液。以15-30°的角度倾斜平板，从每个孔的角部移液，以确保完全去除血浆溶液。
*通过以最高速度涡旋5秒，混合稀释的过夜培养物（在该实施例中，4ml在生物膜培养基中的稀释的过夜培养物），并立即将1ml转移到来自步骤7的3个涂覆有等离子体的孔中。
*转移1毫升无菌生物膜介质到第四（空）血浆涂层井。这将作为无菌技术的阴性对照。
将24孔组织培养板置于37℃培养板中培养7小时
生长后，目视检查阴性对照孔的污染。阴性对照孔应该看起来与无菌培养基的外观相同（即不存在混浊生长或颗粒物质）。如果在阴性对照孔中发生污染，则不要继续实验的其余部分
*通过用P1000移液管强力吸取，混合和刮下孔底部，从每个孔收获总生物量（生物膜+上清液）。根据生物膜厚度，该步骤通常需要每个孔30秒-1分钟。在这个和随后的步骤中，在无菌环境中进行工作不是样品完整性的必要条件。然而，当使用BSL-2生物体时，它们应当在生物安全柜下进行。还应当适当注意使样品的交叉污染最小化。有关此步骤的示例，请参阅视频1。将每个孔的内容物转移到无菌的1.7ml微量离心管中
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视频1.来自24孔组织培养板的生物膜收获的演示

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通过在室温下以17,000×g离心5分钟收集细胞
当样品在步骤13中离心时，使灯变暗，从-20℃冰箱中取出5μl等分的5mM DAF-FM二乙酸酯储备溶液，并通过涡旋解冻。
注意：DAF-FM非常光敏，因此请确保执行所有后续步骤与降低灯。只要DAF-FM不直接暴露于光源，昏暗的环境光（即来自窗口的自然光）是可接受的。
一旦解冻，准备DAF-FM二乙酸酯工作溶液。 DAF-FM二乙酸酯的工作溶液应该用箔包裹，直到在下面的步骤17中使用。如果在使用前在下面的步骤17中制备5μMDAF-FM二乙酸盐溶液，则该方案效果最好。
*用P1000移液管（视频2）从每个离心管中完全除去培养物上清液（步骤13）。

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视频2.从离心细胞沉淀中去除上清液的示例

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*将每个细胞沉淀重悬在1ml5μMDAF-FM二乙酸酯（在步骤15中制备）中。

金黄色葡萄球菌细胞沉淀不能单独通过涡旋重新悬浮，因此使用P1000移液管通过刮擦和移液分离细胞沉淀（视频3），然后以最高速度旋转管子10秒。

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视频3.在DAF-FM二乙酸盐溶液中显示细胞沉淀重悬。

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孵育所有管60分钟，在37℃在板培养箱。管可以覆盖箔，以减少暴露于环境光，如果这是一个关注
当细胞悬浮液在步骤18中孵育时，新鲜制备以下溶液：100μMDEA在1x HBSS中，100μMDEA/NO在1x HBSS中。
通过在室温下离心5分钟收集细胞沉淀物，17,000×g
*按照步骤16和视频2中所述弃去上清液。
*要清洗细胞沉淀中的残留细胞外染色，按照步骤17和视频3所述，将每个沉淀重悬于1ml 1×HBSS缓冲液中。
通过在室温下离心5分钟收集细胞沉淀物，17,000×g
*按照步骤16和视频2中所述弃去上清液。
*如下所述重悬每个细胞沉淀（如步骤17和视频3中所述）：
1. （"用DAF-FM二乙酸酯染色的未处理"细胞;细胞内NO/RNS的基线水平）
2. 1颗粒在含有100μMDEA（用DEAF-FM二乙酸酯染色的"DEA"处理的细胞;在下面步骤25c中使用的化学NO供体的DEA部分的对照）的0.65ml 1×HBSS中，
3. 1颗粒在含有100μMDEA/NO（用DEA-FM二乙酸酯染色的"DEA/NO"处理的细胞;相对于未处理和DEA处理的样品应当产生高水平细胞内荧光的阳性对照）的0.65ml 1x HBSS中，
注意：在此步骤中重要的是，样品池密度彼此非常相似。根据我们的经验，OD 600的小变化（即，彼此在10％以内的样品OD 600个值）可以通过将数据报告为RFU/OD（如下面步骤28所述）。然而，样品之间的OD 600的较大变化将导致不一致/难以解释结果。因此，建议在该步骤检查OD <600>，并且在使用不同的生长条件或怀疑在初始培养温育期间以不同速率生长的生物样品时，相应地调节样品体积（步骤10）。对于金黄色葡萄球菌样品，我们通常瞄准每孔OD 600?1.0。然而，我们还观察到具有高达2.0的良好OD 600值的可重复结果，同样只要给定实验中所有样品的OD 600值非常相似彼此。
立即将200μl等份的每种细胞悬浮液一式三份转移到Costar 3904 96孔板的孔中（视频4和图1）。另外，将200μl1×HBSS的等分试样一式三份转移到该96孔板（该"仅缓冲液"样品用作可归因于缓冲液本身的任何背景荧光的阴性对照）。1 HBSS倾向于具有相对于细胞样品）。如果这是一个需要考虑的问题，板可以覆盖在箔中以减少暴露在环境光下
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视频4.将样品加载到96孔板中的示范

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图1.在96孔板中一式三份装载的DAF-FM染色的细胞样品的示意图（步骤26）。在本实施例实验中，阳性对照中预期有更高水平的DAF-FM荧光用DEA/NO（化学NO供体;深绿色孔）处理的细胞样品，而在DEA处理和未处理样品（浅绿色孔）中通过DAF-FM荧光检测内源细胞内NO/RNS预期彼此相似，且均低于经NO处理的阳性对照样品。单独的缓冲液（不存在DAF-FM染色;白色孔）相对于DAF-FM染色的细胞样品应具有非常低的自发荧光水平。
将此96孔板在Biotek Synergy HT荧光板读数器中孵育。时间过程方案设置应包括以下：在每个读数之前37℃，3秒中等摇动，每15天记录荧光（EX/EM 485±10/516±10）和OD 600次测量min，总共60分钟。对于 s。 aureus样品，每个样品的峰值荧光通常发生30分钟
报告数据为每个孔的OD 600的相对荧光单位（RFU）。请参阅（Lewis等人，2015; Sapp等人，2014年）和图2的代表性数据。

图2.检测细胞内NO/RNS。 aureus 与DAF-FM二乙酸酯。将从重复的UAMS-17h静态生物膜收获的细胞重悬于含有5μMDAF-FM二乙酸酯的1×HBSS中。在37℃孵育1小时后，通过离心收集细胞，洗涤，并重悬于单独的1×HBSS（"未处理的"）或补充有100μMDEA或100μMDEA/NO的1×HBSS中。将每个细胞悬浮液的等分试样（200μl）立即转移到96孔板中，并在Synergy HT荧光板读数器中在37℃下温育。在30分钟后记录荧光和OD 600测量，并且数据报告为每个孔的每OD 600个的相对荧光单位（RFU）。数据表示n = 3次独立实验的平均值，误差条= SEM。 *与未处理的UAMS-1相比的统计学显着性（p <0.05，Tukey试验）。该图中使用的数据集最初发布在（Sapp等人。，2014）中。

笔记

当分析每个实验的小组（3-6）样品时，该方案是最可重复的。根据我们的经验，将实验放大到超过6个样品往往导致实验之间更多的变异性。虽然我们没有详细解释其原因，但是对于多于6个样品所需的增加的样品处理时间可能增加样品对DAF-FM二乙酸酯染色的曝光时间的变化性（步骤17-18）和/或随后的处理步骤（即，如步骤25中所述将细胞样品暴露于DEA/NO），其可进而影响发生在DAF/FM荧光中的DAF-FM荧光的时间和水平样品响应NO。还有可能的是，增加的样品处理时间可以促进DAF-FM二乙酸酯暴露于环境光的更多变化性。通过确保其他生物变量（即，过夜培养物和生物膜的生长时间）在实验之间保持一致，实验之间的变异性也可以最小化。
实验应重复3-6次，以获得足够的功率进行统计分析。在我们的经验中，数据往往遵循非正态分布，因此非参数检验用于分析数据的重要性。
虽然DAF-FM也可以与某些RNS如亚硝鎓离子反应，但是大部分荧光信号已经显示是由于NO引起的（Kojima，Nakatsubo等人1998，Kojima，Sakurai，等，1998）。由于NO基团本身相对不稳定，并且当暴露于细胞组分时可快速产生其它RNS，所以细胞内DAF-FM荧光应被认为是NO水平的间接测量。
作为另外的对照，将2-（4-羧基苯基）-4,5-二氢-4,4,5,5-四甲基-1H-咪唑基-1-氧-3-氧化物，单钾盐（cPTIO），NO清除剂，可以添加到 S。在1小时DAF-FM二乙酸酯染色步骤（步骤17）期间，将金黄色葡萄球菌细胞悬浮液浓缩至150μM。
虽然该协议最初被开发用于检测细胞内NO。金黄色葡萄球菌生物膜培养物，我们也使用它与轻微的修改来评估。在从浮游培养物和从琼脂平板收获的细胞中的金黄色葡萄球菌细胞内NO水平（Sapp等人，2014）。然而，当开发用于其它细菌或古细菌物种的该测定时，使用的DAF-FM二乙酸盐浓度，染色孵育时间（步骤17）和荧光测量的时间/频率（步骤27）将需要仔细优化。根据制造商的说明，建议最初测试1μM-10μMDAF-FM二乙酸酯的浓度范围和15-60分钟染色时间，以确定实验的最佳参数。根据制造商的方案，在初始DAF-FM染色步骤后可能需要额外的15-30分钟，以允许细胞内二乙酸酯的完全脱酯化和细胞内DAF-FM的释放。当优化该测定时，也建议运行合适的DEA/NO和cPTIO对照。如果在优化的测定条件下的结果是可重复的，则这些对照可以从未来的实验中省略，以便能够每个实验处理更多的"未知"样品。同样，取决于实验的生长条件，被测试的微生物，以及何时，可能需要延长或缩短荧光读板器中的RFU/OD 600数据收集的孵育时间和/或频率发生最早的"峰"DAF-FM荧光。

食谱

50％（v/v）甘油储备液
将50ml甘油与50ml去离子H 2 O混合。使用150 ml Nalgene无菌一次性0.2μm过滤器过滤灭菌，或通过高压灭菌（液体循环30分钟）灭菌。
生物膜媒体
将3g TSB，3g NaCl和0.5g葡萄糖溶解在100ml去离子H 2 O中。转移到200ml玻璃介质瓶和高压釜液体循环20-25分钟。为每周的实验准备新鲜制备的培养基。生物膜培养基> 1周龄往往导致生物膜生长的变化增加
碳酸盐 - 碳酸氢盐缓冲液
将一个碳酸盐 - 碳酸氢盐胶囊的内容物倒入100ml去离子H 2 O中并溶解。一个胶囊的内容物在25℃下产生100ml的0.05M碳酸盐 - 碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6。使用150-ml Nalgene无菌一次性0.2μm过滤器单元过滤灭菌
20％人血浆
将20ml碳酸盐 - 碳酸氢盐直接加入其原始小瓶中的5ml冻干人血浆中。轻轻混合几分钟以溶解。该溶液将呈现为半透明的浅黄褐色。储存于4°C。
DAF-FM二乙酸酯储备液
根据制造商的说明，通过将1mg包装（D-23841）溶解（涡旋以溶解）在0.4ml高品质无水DMSO中，制备5mM DAF-FM二乙酸酯储液（MW = 496）。一旦溶解在DMSO中，DAF-FM二乙酸酯储备溶液不耐受反复的冻融。因此，将储备溶液分成方便的一次性使用工作体积（5-10μl）到在冰上预冷的无菌1.7ml微量离心管中。标签管，立即存放在-20°C的不透光容器中。
0.01 M NaOH溶液
通过将200mg NaOH（FW = 40g/mol）溶解在500ml去离子H 2 O中制备0.01M NaOH溶液并溶解。使用500-ml Nalgene无菌一次性0.2μm过滤器单元过滤灭菌
DEA/NO储备液
根据制造商的说明，通过涡旋将10mg小瓶的DEA/NO（FW = 206.3）溶解在323.2μl的0.01M NaOH中制备100mM储备溶液。一旦在溶液中，DEA/NO不耐受反复的冻融。因此，立即等分作为小工作体积（20-50μl）到在冰上预冷的无菌的1.7ml微离心管中，并储存在-80℃。如果已经在-80℃下储存超过两周，则不要使用DEA/NO储备溶液
cPTIO储液
通过将整个5mg内容物的cPTIO小瓶溶解在105.7μl无菌无核酸酶H 2 O中制备150mM cPTIO储备溶液（FW = 315.4g/mol）。通过涡旋混合。在本方案的步骤15期间，应该为每个实验新鲜制备。根据制造商的说明，cPTIO的水溶液不稳定超过一天
DAF-FM二乙酸酯工作溶液
通过将解冻的5mM DAF-FM储备液的等分试样稀释1000倍至1x HBSS缓冲液中，制备5μM的DAF-FM二乙酸酯工作溶液。通过涡旋混合。在本协议的第15步中，应为每个实验准备新鲜的
DEA /无工作溶液
通过添加3.33微升DEA/NO储备溶液到5毫升1 HBSS中准备一个100μM工作溶液。在本协议的第19步中，应为每个实验准备新鲜的
DEA工作溶液
首先，通过向5ml 1x HBSS中加入51.7μlDEA（0.707g/ml密度，FW = 73.14g/mol）制备100mM DEA储备溶液。然后，在1x HBSS中将该1,000倍稀释至100μM工作溶液。在本协议的第19步中，应为每个实验准备新鲜的

致谢

这项工作的部分资金来自佛罗里达大学新兴病原体研究所，佛罗里达大学IFAS早期职业奖和NIH授予AI118999，所有到KCR的重新提交资金。该协议和图2中描绘的数据集都已经从（Sapp等人，2014）改编，并且在此根据PLOS ONE的知识共享署名（CC BY）许可策略被再现。

参考文献

Gillaspy，AF，Hickmon，SG，Skinner，RA，Thomas，JR，Nelson，CL和Smeltzer，MS（1995）。辅助基因调节子（agr）在葡萄球菌性骨髓炎发病机理中的作用 Infect Immun 63（9）：3373-
Kojiima，H.，Nakatsubo，N.，Kikuchi，K.，Kawahara，S.，Kirino，Y.，Nagoshi，H.，Hirata，Y.and Nagano，T。（1998）。用新型荧光指示剂检测和成像一氧化氮：二氨基荧光素。 Anal Chem 70（13）：2446-2453
Kojima，H.，Sakurai，K.，Kikuchi，K.，Kawahara，S.，Kirino，Y.，Nagoshi，H.，Hirata，Y.and Nagano，T。（1998）。基于荧光素发色团的一氧化氮荧光指示剂的开发。 em> Chem Pharm Bull （Tokyo）46（2）：373-375
Koijima，H.，Urano，Y.，Kikuchi，K.，Higuchi，T.，Hirata，Y.and Nagano，T。（1999）。用于成像一氧化氮生产的荧光指示剂。 Angew Chem Int Ed Engl 38（21）： 3209-3212。
Lewis，A.M.，S.S.Matzdorf，J.L.Endres，I.H.Windham，K.W.Bayles和K.C.Rice。（2015）。检查金黄色葡萄球菌一氧化氮还原酶（saNOR）显示其对调节细胞内无水平和细胞呼吸的贡献。 Mol Microbiol 96：651-69。
Sapp，A.M.，A.B.Mogen，E.A.Almand，F.E.Rivera，L.N.Shaw，A.R.Richardson和K.C.Rice。（2014）。 nos-pdt操纵子对在甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌中的毒力表型。 9：e108868。