材料和试剂

组织培养6孔板（Thermo Fischer Scientific，目录号：130184）
吸移管（5ml，10ml）
50ml锥形管（Thermo Fischer Scientific，目录号：339653CS）
微覆盖玻璃（VWR International，目录号：89015-724）
细胞刮刀（Thermo Fischer Scientific，目录号：179693）
0.22μm消毒过滤器Filtropur（Sarstedt，目录号：83.1826.001）
人胚胎干（hES）细胞系HUES9（Harvard干细胞研究所）或H9细胞（WiCell，目录号：WA09）
hES细胞培养基（Peprotech，目录号：BM-HESC-500）
N2补充剂（Gibco，目录号：17502-048）
B27补充剂（Gibco，目录号：17504-044）
DMEM/F12（Gibco，目录号：11320-033）
NEAA（Gibco，目录号：11140-050）
人类FGF碱性（Peprotech，目录号：100-18B-50UG）
肝素（Sigma-Aldrich，目录号：H3149-10KU）
人IGF-I（Peprotech，目录号：100-11）
人重组COCO（R& D Systems，目录号：3047-CC）
Accutase溶液（100ml）（Sigma-Aldrich，目录号：A6964）
岩石抑制剂Y-27632（盐酸盐）（Cayman chemical，目录号：10005583）
减少生长因子基质胶（Corning，目录号：354230）
hES细胞基质胶（Corning，目录号：354277）
Trizol试剂（Thermo Fisher Scientifc，Ambion ^{TM，目录号：15596026）}
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：04693116001）
（FisherBiotech，目录号：BP332-500）。
NaCl（Amresco，目录号：0241）
KCl（EMD Millipore，目录号：PX1405-1）
（FisherBiotech，目录号：BP362-1）
结晶PFA（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
1x PBS
针对CRX，S-视蛋白，ABCA4和锥细胞抑制素的抗体
CI介质（参见配方）
10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（参见配方）
4％多聚甲醛（PFA）（参见配方）
hES合格的基质胶板涂层（见配方）

设备

37℃，5％CO 2水夹套培养箱（Thermo Fisher Scientific，目录号：3110）
P1000，P200移液器
显微镜（Leica，型号：DM IL）
用于50ml锥形管（Thermo Fisher Scientific，Centra GP8R，031220F）的冷冻台式离心机

程序

人胚胎干细胞（hES）细胞的制备和电镀 - 时间：第-6天至第0天
1. 使用hES细胞培养基（参见材料和试剂）（图1），在基质胶包被的平板上培养hES细胞系HUES9（参见hES限定的Matrigel in Recipes）直到它们形成大的集落（?1×10 6个细胞） 1A）。
2. 使用预冷的5ml移液管和200μl移液管吸头在冰冷的DMEM/F12中稀释还原的生长因子基质胶：将100μl基质胶在冰上和6ml冰冷的DMEM/F12混合。
3. 向6孔板的每孔中加入1ml新鲜制备的基质胶。
  注意：在添加基质胶进行免疫荧光分析之前，请放置无菌盖玻片。
4. 均匀地分布基质胶并在37℃下孵育30分钟到水夹套培养箱中
5. 在基质胶孵育期间，丢弃hES细胞培养基并用1ml在37℃预热的1×PBS洗涤。
  注意：该方案适用于使用具有大hES细胞集落的6孔板的3孔作为起始材料。
6. 弃去PBS，加入1ml在室温下预热的Accutase
7. 孵育hES细胞平板，直到细胞在37℃（1-2分钟）开始分离（圆形细胞）。
8. 停止与1毫升hES细胞培养基的反应。
9. 通过上下吹吸，用P1000移液管吸头将细胞收集到50 ml锥形管中
10. 加入6ml温热的hES细胞培养基
11. 加入ROCK抑制剂Y27632以达到10μM的终浓度
12. 在室温下以1,300rpm（400xg）离心5分钟
13. 弃去上清液并将细胞重悬于12ml温热的hES细胞培养基中
14. 加入ROCK抑制剂Y27632至终浓度为10μM
15. 从培养箱中取出基质胶包被的板，弃去每个孔上剩余的DMEM/F12。
16. 在基质胶包被的板的每个孔中分配2ml hES细胞悬浮液
17. 旋转板并孵育在37℃的培养箱中
18. 每天更换培养基，直到细胞达到完全融合（100％）
区分时间：第0天到第21天
1. 准备和无菌过滤器CI介质需要两周。
2. 完全融合后，从板中取出hES细胞培养基，加入2ml新鲜制备的CI培养基（图1B）。
3. 通过在孔侧面缓慢分配温暖的CI培养基至少21天来更换培养基（图1C）。
细胞收集和分析
1. 用于基因表达分析
2. 用于蛋白质分析
  使用细胞刮刀分离培养基中的细胞。以1,300rpm离心5分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于200μl蛋白酶抑制剂中，-20℃保存或进行蛋白提取。可以通过使用针对CRX，S-视蛋白，锥细胞抑制蛋白和锥体转导的抗体的蛋白质印迹分析蛋白质表达（Zhou等人，2015）。
3. 用于免疫荧光分析弃去培养基，用1ml 1×PBS洗涤并加入1ml 4％的新鲜PFA。在室温下孵育10分钟。丢弃PFA，并使用针对CRX，S-视蛋白，ABCA4和锥细胞抑制蛋白的抗体进行免疫荧光。盖玻片可以在二次抗体孵育后安装在载玻片上（图1D）（Zhou等人，2015）。

代表数据

图1：在方案的不同时间点的hES细胞的代表性图像。 A.大的hES细胞集落准备用于传代。比例尺：500μmB.准备开始分化的hES细胞的铺满层（100％融合）。比例尺：100μm。C.分化21天后获得的细胞。比例尺：100μm。分化21天后的分化细胞用光感受器标记物CRX和S-Opsin标记。比例尺：100μm。

笔记

起始hES细胞的质量对于获得良好的分化效率是必需的。因此，建议通过检测hES细胞标志物如Tra1-60，Oct3/4，SSEA4和Nanog来评估细胞的多能性。该协议已使用HUES9细胞系或H9细胞进行测试，并通过检测CRX，S-Opsin，Recoverin和ABCA4来确认分化效率。
使用Accutase对于在与胰蛋白酶相反的再接种后获得良好的细胞活力是必需的。

食谱

10x磷酸盐缓冲液（PBS）
将25.6g Na 2 HPO 4 7H 2 O 2，80g NaCl，2g KCl，2g KH 2 PO 4， sub> PO ₄
用H 2 O调至1升。
在121°C高压灭菌40分钟。
CI媒体
添加所有这些组件：
48 ml DMEM/F12
0.5ml N2补充液（100x）
1 ml B27补充剂（100x）
0.5ml NEAA（100x）
12.5μl人FGF碱性（10ng /μl）
5微升肝素（10微克/微升）
5μl人IGF-I（100ng /μl）
7.5μl人重组COCO（200μg/ml）
过滤灭菌（0.22μm）并储存在4℃。
在两周内使用。
4％PFA
在烧杯中称取16g结晶PFA，加入400ml 1×PBS。盖上并加热溶液直到粉末完全溶解（50℃）。等分并储存在-20°C
hES合格的基质胶板涂层
使用预冷的10ml移液管和P1000移液管吸头在冰冷的DMEM/F12中稀释hES-限定的基质胶：将对应于稀释因子（见证书）的一定体积的基质胶在冰上混合，并与25ml冰冷的DMEM/F12混合。分配1毫升稀释基质胶每孔的6孔板和孵育30分钟，在37℃下，在水夹套孵化器。在使用前丢弃多余的DMEM/F12

致谢

我们感谢D.梅尔顿和哈佛大学干细胞研究所为HUES9细胞系。这项工作得到了基金会战斗盲人加拿大，图尔特家庭基金会黄斑变性研究，加拿大干细胞网络，C.杜兰德基金会，GO基金会和加拿大自然科学和工程研究理事会（批准＃250970-2012 ）。 A.F.得到魁北克地区RéseauVision大学和蒙特利尔大学分子生物学计划的奖学金支持。 G.B得到魁北克省魁北克省政府的支持。

参考文献

Zhou，S.，Flamier，A.，Abdouh，M.，Tetreault，N.，Barabino，A.，Wadhwa，S. and Bernier，G.（2015）。通过同时抑制BMP，TGFbeta和Wnt信号分化将人胚胎干细胞分化成锥形感受器。 142（19）：3294-3306。