材料和试剂

白色透明底96孔板（Sigma-Aldrich，Corning），目录号：3610）
无菌密封膜（Sigma-Aldrich，Breathe-Easy ，目录号：Z380059）
15-ml试管（VWR international，目录号：525-0150）
96孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：167008）的孔中，
冷冻瓶（可选）（Cryoinstant）（Deltalab，目录号：409113/6）
一次性1mm路径长度比色杯（Sigma-Aldrich，Brand ，目录号：Z637092）
Vibrio campbellii 菌株
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
MgSO 4（Sigma-Aldrich，目录号：M7506）
蛋白水解酶Amicase（Sigma-Aldrich，目录号：82514）
去离子水
NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：S5881）
甘油
磷酸二氢钾（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
磷酸氢二钾（Sigma-Aldrich，目录号：1551128）
L-精氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A5006）
卡那霉素（Sigma-Aldrich，目录号：K1377）
肉桂醛（Sigma-Aldrich，目录号：W228613）
海洋琼脂（MA）（Conda，目录号：1217）
自动诱导剂生物测定（AB）培养基（参见配方）

设备

EnSPire ^?多模式读板器（PerkinElmer，型号：2300-0000）
管旋转器（Grant-bio，型号：PTR35）
分光光度计（Beckman Coulter，型号：DU 530）

软件

GraphPad Prism（GraphPad Software，Inc。）
Microsoft Excel（Microsoft Corporation）

程序

用冷冻保存的V板条纹MA板。 Campbellii 菌株。孵育单菌落在30℃下24-36小时。如果需要，用合适的抗生素（例如，卡那霉素，见图4的流程图更多细节）补充板。
注意：我们通常制备两种细菌菌种：第一种在商业冷冻小瓶中用珠子储存在我们的菌株仓库中，第二种在25-30％甘油中用作工作储备液。两者都保存在-80℃。即使我们没有遇到任何问题，我们使用这个股票的副本，因为反复冻结和解冻可以损坏细胞，特别是如果他们常规使用。
对于一个条纹，我们只使用1-μl接种环或任何其他无菌材料。我们在孵育24-36小时后从单菌落开始测定。该琼脂平板可以在4-5℃下保存至少1周而不丧失重现性。或者，培养物可以直接从原种制备;在这种情况下，我们建议使用10μl接种3 ml AB培养基（见下一步）。
准备一个文化的。 Campbellii感兴趣的菌株，通过在15ml管中接种新鲜菌落的3ml AB培养基。在管式旋转器（40rpm）中在30℃下孵育过夜至约0.5（OD路径长度）的OD 600.
将100μl的测试化合物的2×稀释液在AB培养基中分配到白色透明底96孔板的孔中。如果需要，可以在板中制备系列稀释液。
注意：我们通常在DMSO中制备80mM的测试产品储备液。使用200μM的截止剂量产生0.25％v/v的最大溶剂浓度，其对细菌生长和发光没有显着影响。
每个板中包括无处理对照和溶剂对照，以及100μM肉桂醛（阳性对照）和水（阴性对照）（图1）。

图1.板分布示出样品孔（x80），未处理对照孔（NTC，x3），溶剂对照孔（SC，x3），阳性对照孔（PC，x3），阴性对照孔x3）和空白孔（x4）。如果需要，从A行到H行建议连续两倍稀释的测试化合物。
稀释隔夜。 campbellii 培养物1:50在新鲜的AB培养基中。这得到将进一步以1:2稀释的约1-2×10 7/mL CFU ml ^-1的接种物（参见下一步骤）。
注意：当在实验室中建立该方案时，我们建议验证接种物的细胞密度，如Harrison等人，2010所述。简言之，将180μl的AB培养基分配到无菌96孔的四个柱板。从A行到H行。将20μl接种物移液到A行孔内并连续稀释（-1至-8稀释）。使用多通道移液管，将10μl的稀释液点在MA板的表面上。每个稀释物的多达四个重复可容易地点在标准的90-100mm琼脂平板上。将斑点在生物安全柜内干燥，将板在30℃下孵育24小时以进行CFU计数。为了精确测定细胞密度，考虑可以计数单个菌落的最低浓度。每ml的CFU为= x 10 ^{（d + 2）/sup>，其中n表示4次重复的每一次中的菌落计数，d表示相应的稀释度。测定中的实际细胞密度将是该计算的一半。}
将100μl稀释的细菌培养物分配到孔中。
用无菌，透气和透明的密封膜密封板（图2）注意：使用涂层仔细密封板。在板被正确密封之前，不要取下外部保护盖，以免污染。

图2.密封，白色，透明底部96孔板的外观
孵育板在30℃下18小时和内轨道摇动（150 rpm）。取OD <600>和每15分钟的发光读数注意：使用EnSpire ^?多模式板读取器时，建议使用板尺寸，测量高度和Z'优化。类似地，平场和串扰校正优化读数。我们不建议使用板和检测器之间的距离低于0.6 mm（否则，由于密封膜的损坏可能会发生污染）。激活密封板的冷凝防止选项（加热器上部温度比加热器温度低2°C）。

数据分析

减去OD <600>和发光（Microsoft Excel）的背景值
注意：在发光读数中，串扰与孔位置的函数略有不同。因此，中心孔更易受井 - 井光串扰的影响。考虑这种效应的暂时板分布示于图1中。测量参数的优化减少了这种现象，尽管它甚至在适当的优化下发生。然而，空白孔中的发光读数总是比对于样品孔记录的读数至少低两个数量级，因此，串扰对我们的实验设置产生可忽略的影响。
使用科学绘图软件（例如GraphPad Prism）表示细菌生长和生物发光的时间 - 过程曲线（图3）。确定曲线下面的面积，并计算治疗相对于每个变量的对照的相对抑制注意：对于每个剂量或治疗，将发光数据归一化到OD 600是有用的，即NL = 其中NL =归一化发光，AULC =发光曲线下面积，AUGC =生长曲线下面积。

图3.在18小时的测定期间显示典型的NTC生长曲线（黑色方块）和重叠的相应的发光曲线（蓝色方块）的图表。 strong> 数据表示三次重复的平均值和标准偏差
使用这些数据，使用非线性回归（GraphPad Prism）计算相应的IC <50>值。
发现Quorum Sensing Inhibitors的建议工作流程（图4）。

图4.使用vibrio campbellii QS突变体测试和表征推定的Quorum Sensing Inhibitors的活性的流程图。

食谱

AB中等
17.5g NaCl
12.3g MgSO 4 2.0克酪蛋白氨基酸
970毫升去离子水
溶解成分，用3N NaOH使溶液的pH值达到7.5 在121℃下高压灭菌，并在完全冷却后，从单独的过滤灭菌的原液中加入以下成分：
10ml 1M磷酸钾（pH 7.0）
10ml 0.1M L-精氨酸 10ml甘油

致谢

该协议是由西班牙经济和竞争力部提供的资金支持开发的，授予CTQ2014-55888-C03-01。 A.J.M-R。从PLOCAN获得奖学金。该协议是从Martín-Rodríguez等人发表的改编。 2015a和2015b。

参考文献

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