材料和试剂

纱布垫
无菌罩
4-0平肠缝合，18"，PS-4针（Ethicon）
手持烧灼：高温灼热细尖（Bovie Medical，型号：AA01）
野生型CD-1小鼠（8-12周龄）（Charles River Laboratories International）
异氟烷（异性）（Henry Schein Animal Health）
兽用软膏（Dechra，Puralube ^?眼用软膏）
10％聚维酮碘制备溶液（Dynarex，目录号：1413）
0.3mg/ml丁丙诺啡（Buprenex）（Reckitt Benckiser）

设备

电动剪刀
剪刀
CO 2室
远红外加热垫（Kent Scientific）

程序

程序说明
1. 确保去神经治疗程序获得足够的机构动物护理批准。用2-3％吸入异氟烷诱导麻醉。眼睛软膏应用于双眼，以防止手术期间角膜的干燥。
2. 使用脚趾捏趾操作，以确保麻醉深度足够。
3. 在开始手术前，皮下施用0.1mg/kg丁丙诺啡
4. 神经神经去神经
  1. 将鼠标放置在一个干净，吸湿的表面上的调节加热垫顶部的俯卧位。
  2. 用电动剪刀从大鼠后大腿和下背部摘除毛发（图1）。
    
    图1.坐骨神经暴露的后部手术部位。刮除足够大小的区域可防止手术部位的污染。
  3. 无菌制备剃光的皮肤与聚维酮碘溶液和悬垂无菌帷幕。确保在整个手术过程中保持无菌技术。只要手术区保持无菌，就不需要抗生素
  4. 使用无菌技术，切开平行的股骨在背大腿的皮肤。使用小的锋利的剪刀传播组织在皮肤下面，以动员皮肤远离下面的肌肉。使用自固定皮肤钩打开手术部位很有帮助。
  5. 股骨将在肌肉内可见（图2;箭头指示股骨）。使用锋利的剪刀，小心地划分肌肉平行于和刚好在股骨。这将揭示坐骨神经。（图3;箭头表示坐骨神经）。皮肤钩子可以插入肌肉，以改善神经的暴露
    
    图2.股骨的暴露。坐骨神经最初不可见，但位于此处所见的股骨表面的下方和深处。
    
    图3.坐骨神经的暴露。暴露神经需要用细剪刀进行精细的解剖。
  6. 通过切除位于手术区域中心的坐骨神经的5mm截面获得去神经（图4; P，近端D，远端）。去除5毫米的神经，而不是简单的切割，可以防止神经的愈合和再生
    
    图4.坐骨神经的分割。去除5毫米的神经阻止再生。
  7. 用手持烧灼器灼烧近端神经的切断端1秒，以进一步防止再生。（换句话说，烧灼仍附着在脊柱上的神经末端，而不是连接到远端肢体的末端）。
  8. 如果有任何出血，用纱布保持压力以获得止血。用几个中断的4-0可吸收缝线闭合皮肤切口（图5）。
    
    图5.后切口闭合。缝合线应足够靠近，切口中无间隙。
5. 股神经去神经支配
  1. 将鼠标放在仰卧位置在清洁，吸收表面上的调节加热垫的顶部。
  2. 从下腹部，腹股沟和整个大腿的侧面剃刮头发进行手术（图6）。
    
    图6.用于股神经接近的前部手术部位。将头发刮过中线，并将其刮到前肢的中途。
  3. 无菌制备剃光的皮肤与聚维酮碘溶液和悬垂无菌帷幕。确保在整个手术过程中保持无菌技术。只要手术区保持无菌，就不需要抗生素
  4. 做一个切口平行于股骨几乎延伸到小鼠的中线。使用小锋利的剪刀，铺在皮下，以从下面的肌肉松开
  5. 股骨神经，动脉和静脉将立即可见，作为平行于股骨的束运行（图7;箭头表示束）。使用具有精细运动的小尖锐剪刀，从围绕它的组织释放股神经的近端部分（图8;箭头表示被夹在剪刀上的股神经的近端部分）。切除腹壁附近的5 mm神经节段，并使用手持烧灼器灼烧神经近端部分的切断端1秒钟。
    
    图7.股骨神经和动脉的暴露。从股动脉和静脉分离股骨近端神经需要使用细剪刀进行非常精细的解剖。
    
    图8.近侧股神经的暴露。看到被分开的神经的部分覆盖在剪刀上。小心避免剪切股骨血管。
  6. 小心不要打扰股动脉和静脉。如果偶然发生这些血管的出血，用纱布垫施加稳定的压力。如果出血不能在保持压力5分钟后停止，则应立即对动物实施安乐死。我们的典型安乐死方法是将静止麻醉的小鼠放入CO 2室中，直到呼吸停止，然后进行颈椎脱臼。然而，最好在开始手术前咨询机构兽医，以确定安乐死的首选方法。
  7. 用几个中断的4-0可吸收缝线闭合皮肤切口。
术后护理监护
1. 手术后，允许小鼠在加热垫顶部的纸衬里笼中恢复。监测呼吸频率和模式，对刺激的反应，以及每15分钟恢复正常活动的能力，直到完全清醒（图9）。一旦小鼠完全从麻醉中恢复并可走动，将其放入一个干净的家笼。确保在鼠标清醒之前用温水清洁皮肤和毛皮上的大部分碘。
  
  图9.鼠标从手术中恢复。将鼠标放在干净的纸巾上，以避免吸入笼子。监视鼠标，直到它能够移动。
2. 吸入麻醉停止后，小鼠的呼吸频率预计将恢复到80-200的正常速率，并应在5分钟内开始响应刺激，并在10分钟内恢复正常活动。呼吸频率持续低于每分钟60次呼吸，5分钟后不响应刺激或10分钟后恢复正常活动的小鼠可能无法恢复，应考虑进行安乐死。
早期安乐死标准
手术后一周，每天监测小鼠的一般外观，活动水平，体重减轻，感染迹象，以及该区域大型充满液体的囊肿的发展。如果这些迹象发展，咨询兽医或安乐死动物
程序端点
基于实验的要求，在安乐死和收获肢体之前，对小鼠进行不同量的时间。在我们的组中，我们等待8-12周收获组织

笔记

此协议完全删除任何坐骨神经输入到后肢。然而，股神经分支支配腿和脚的皮肤组织以及韧带，关节和血管，并且可能与坐骨神经提供的区域重叠。因此，我们希望确保在后肢组织上进行完全去神经支配，并且在坐骨神经去神经支配后，股神经供应不能代替坐骨神经的需求（电学，化学或功能）。为了实现这一点，进行坐骨神经和股骨神经的手术去神经，并且在数字尖端截肢之前两周允许发生完全神经变性。完全神经变性可以通过监测β3微管蛋白在去神经后肢的组织切片上的免疫反应性来验证。虽然单独的坐骨神经支配消融使远端肢体不能神经支配，但是执行股骨消融以确保在再生时间间隔期间不会发生来自近端肢体的神经再生。此外，在大腿和股骨筋膜鞘的腹部皮肤中进行切口。通过切割股骨神经的5mm截面，留下股动脉完整来实现股神经去神经。假手术通过暴露神经而不切割它们来进行。

致谢

Y.R.由Machiah基金会奖学金，Siebel干细胞研究所和Thomas和Stacey Siebel基金会（1119368-104-GHBJI），人类前沿科学计划（HFSP）长期奖学金，以及部分由HFSP职业发展奖（CDA00017/2016）和来自德国研究基金会（DFG，RI 2787/1-1 AOBJ：628819）。 C.D.M.由美国外科医师学院驻地研究奖学金支持。

参考文献

Kumar，A.，Godwin，JW，Gates，PB，Garza-Garcia，AA和Brockes，JP（2007）。成年脊椎动物中肢体再生的神经依赖性的分子基础。 318（5851）：772-777。 br />

Rinkevich，Y.，Montoro，DT，Muhonen，E.，Walmsley，GG，Lo，D.，Hasegawa，M.，Januszyk，M.，Connolly，AJ，Weissman，IL和Longaker，MT（2014）克隆分析揭示哺乳动物后肢组织的神经依赖性和独立作用维护和再生。 Proc Natl Acad Sci USA 111（27）：9846-9851。

Singer，M.（1947）。神经系统和再生的成人Triturus的前肢;神经纤维数目和截肢表面积之间的关系。 104 104（2）：251-265。

Singer，M。（1952）。神经再生的两栖肢。 27（2）：169-200。

Stover，SL，Hale，AM and Buell，AB（1994）。除了脊髓损伤后的压力性溃疡以外的皮肤并发症。 Arch Phys Med Rehabil 75（9）：987-993。

Stover，SL，Omura，EF和Buell，AB（1994）。通过组织病理学研究的脊髓损伤后的临床皮肤增厚。 J Am Paraplegia Soc 17（2）：44-49。