材料和试剂

聚-L-赖氨酸处理的载玻片（Poly-Prep载玻片）（Sigma-Aldrich，目录号：P0425-72EA）
盖玻片（Matsunami Glass，目录号：C218181）
Dako Pen（Dako，目录号：S2002）
塑料盒（9厘米×19厘米×4厘米）
注意：在此实验中，任何大小都可以。
Kimwipes ^?纸（Kimberly Clark）
感兴趣的细胞
血细胞计数器（Erma，目录号：03-303-6）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
Tween-20（Santa Cruz，目录号：sc-29113）
PBS-T（含0.1％Tween-20的PBS）
多聚甲醛（Nacalai Tesque，目录号：26126-54）
甲醇（Nacalai Tesque，目录号：21915-64）
无球蛋白牛血清白蛋白（BSA）（Nacalai Tesque，目录号：01281-26）
亲和纯化的针对LCIB的兔一抗（Yamano等人，2010）
山羊抗兔IgG（H + L）第二抗体，Alexa Fluor？488缀合物（Thermo Fisher，目录号：A-11001）
安装介质（Vectorshield，目录号：H-1300）
4％甲醛（见配方）
PBS（请参阅配方）
PBS-T（参见配方）
阻塞溶液（参见配方）

设备

Coplin罐（50 ml尺寸）
荧光显微镜Axioscope2（Zeiss）具有特定的滤光片组（激发带通
480/40和发射带通527/30）或激光扫描共焦显微镜TCS SP8
（Leica），具有488nm激光线

注意：这些是我们实验中使用的仪器，但任何公司都可以。

程序

在-20℃下在coplin罐中冷却100％甲醇至少4小时
通过在600×g离心5分钟，在对数生长期收获50ml的莱茵衣藻细胞。该步骤和随后的步骤在室温下进行，除了步骤10之外注意：

衣藻培养基配方可在 http ：//www.chlamy.org/media.html
将培养细胞生长至1-2×10 6个 6 细胞的50ml培养细胞ml 1 已足够。

在小体积（1-2ml）的PBS中重悬细胞，通过血细胞计数器计数细胞数，并使用PBS调节1×10 7个细胞ml -1 -1的细胞密度。
用Dako Pen在聚-L-赖氨酸处理的载玻片上绘制三个圆圈，以提供对液体如阻断溶液，抗体溶液和洗涤缓冲液的屏障（图1A）。在室温下干燥圆圈。
将100μl的衣藻细胞悬浮液置于每个圈中，并让它们空气干燥5分钟以将细胞固定在玻璃杯上。
注意：如果你让他们坐得更长，更多的衣藻细胞会粘附，但细胞鞭毛的末端开始卷曲。
通过将载玻片浸入装有PBS-T的Coplin罐中10分钟，使细胞可渗透（图1B）。
准备一个干净的塑料盒，底部有少量潮湿的Kimwipes ^?纸，以保持空气湿润。
放置玻璃载玻片上的塑料管放置在塑料盒（图1C），并固定蛋白质在细胞内，通过应用100微升含4％（w/v）甲醛的PBS的细胞20分钟。确保溶液在圆内，并且整个细胞被PBS溶液覆盖。

图1.用于间接免疫荧光测定的装置。 A.由Dako Pen在聚-L-赖氨酸处理的载玻片上绘制的圆圈的实例。 B.浸没的玻璃载玻片在装有PBS-T的Coplin罐中。 C.湿润的塑料盒，带有少量潮湿的Kimwipes ^?纸和玻璃片在塑料管的帽子上。
通过将载玻片浸入装有PBS的Coplin罐中5分钟来洗涤细胞两次注意：您不需要在洗涤期间摇动幻灯片或瓶子。
通过将载玻片浸入装有预冷的100％甲醇的coplin罐中在-20℃下固定细胞20分钟来固定细胞。因为叶绿素会溶解，甲醇变成绿色注意：因为冷冻甲醇的温度在固定中很重要，建议在使用前将甲醇保存在-20℃的冰箱中过夜。
通过将载玻片浸入装有PBS的Coplin罐中5分钟来再水合细胞
倒出PBS并重复水化步骤11两次。如果你进行时间实验，你可以让玻璃幻灯片在PBS中坐几个小时，直到你准备好了。
从coplin罐中取出载玻片，让其风干5分钟。
通过在潮湿的塑料盒中应用100微升的封闭溶液1小时，阻止玻璃载玻片上的细胞。
通过将载玻片浸入装有PBS的Coplin罐中5分钟来洗涤细胞两次注意：您不需要在洗涤期间摇动幻灯片或瓶子。
从coplin罐中取出载玻片，让其风干5分钟。
以1：500的稀释率加入50μl含一抗的PBS-T，并在潮湿的塑料盒中孵育细胞1小时。
通过将载玻片浸入装有PBS-T的coplin罐中5分钟来洗涤细胞六次
应用50微升含有PBS-T的二次抗体，稀释率为1：500，并在潮湿的塑料盒中孵育细胞1小时。保持在黑暗中。
通过将载玻片浸入装有PBS-T的coplin罐中5分钟来洗涤细胞六次
应用15微升安装溶液到细胞。确保没有气泡形成。
细胞现在准备通过荧光显微镜用特定的滤光片组（激发带通480/40和发射带通527/30）或具有488nm激光线的激光扫描共聚焦显微镜观察。载玻片可在4℃下在黑暗中储存一周。

图2.间接免疫荧光测定的实际细胞图像和荧光信号 A.在步骤5后在载玻片上固定细胞。比例尺，10μm。 B.在步骤10之后在载玻片上固定细胞。提取叶绿素颜料并且细胞的颜色变透明。比例尺，10μm。 C.衣藻细胞的差异干涉对比图像。箭头指示其中富含CO 2 - 固定酶Rubisco的类固醇结构。比例尺，5μm。 D.源自抗LCIB-抗体的间接免疫荧光信号。 LCIB被检测为如先前报告中所示的类芘周围的环状结构（Yamano等人，2010）。比例尺，5μm。

笔记

我们强烈建议用户也执行相同的实验，使用目标基因突变体作为阴性对照，以区分真实信号和伪像。

食谱

4％甲醛

在搅拌板上将80ml PBS加热至约60℃。
加入4g多聚甲醛，并通过加入1N NaOH缓慢升高pH直至溶液变澄清。
溶解后，冷却并过滤溶液。
用PBS填充体积至100ml，用稀HCl调节pH至约6.9。
等分溶液可以在-20℃保存一个月。

PBS
将8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na 2 HPO 4和0.24g KH 2 PO 4溶解于水中， 4在900ml蒸馏的H 2 O中。用HCl调节pH至7.4，并将H 2 O加至1L。
PBS-T
向PBS中加入0.1％Tween-20（v/v）。
封锁解决方案
PBS缓冲液中的5％（w/v）无球蛋白BSA

致谢

我们感谢王连勇的技术援助。这项工作得到了日本科学促进会科学奖25120714（H.F.）和25840109（T.Y.）和日本科学技术局先进低碳技术研究和发展计划的支持。

参考文献

O anthon，N.，Mukherjee，B.，Tsujikawa，T.，Yanase，M.，Nakano，H.，Moroney，JV和Fukuzawa，H。（2010）。

Shakes，D.C.，Miller，D.M.，3rd and Nonet，M.L。（2012）。免疫荧光显微镜。 Methods Cell Biol 107：35-66。

Yamano，T.，Tsujikawa，T.，Hatano，K.，Ozawa，S.，Takahashi，Y.and Fukuzawa，H。（2010）。合成碳酸氢盐摄入在绿藻中的叶绿体基质中的表征。 Proc Natl Acad Sci USA 112（23）：7315-7320。