材料和试剂

50ml Falcon管（Sigma-Aldrich，目录号：Greiner227261）
Muslin（MacCulloch& Wallis，目录号：4470）
植物
1. 番茄（90至150克破碎剂+3至5天水果每种条件）
2. 甜椒（每种条件30至120g成熟果实;取决于水果色素含量）
3. 辣椒辣椒（约30克成熟果实/条件）
注意：断路器意味着水果上第一个黄色/橙色的视觉外观。在同一天在相同的成熟阶段通常难以获得?10个番茄果实（总共90至150g），因此这就是为什么我们从破碎剂+ 3天到破碎剂+ 5天收获果实。当然，如果你在同一个成熟阶段有足够的水果，它会更好。
DL-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：43815）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：SO389）
Trizma碱（Tris）（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
Tricine（Sigma-Aldrich，目录号：T0377）
亚硫酸氢钠（焦亚硫酸钠）（Sigma-Aldrich，目录号：S9000）
提取缓冲液（参见配方）
渐变缓冲区（参见配方）

设备

冷室（4℃）
-20°C房间
离心Sorvall RC-5C（Thermo Scientific）
定角转子Sorvall GSA-3（紫色）（Thermo Scientific）
定角转子Sorvall GSA-5（绿色）（Thermo Scientific）
超速离心机Beckman L7（Beckman Coulter）
摆动转子SW28（Beckman Coulter）
500ml离心瓶（Thermo Fisher Scientific，Nalgene ^TM，型号：3141-0500）
50ml离心管（厚壁UltraTubes）（Thermo Fisher Scientific，Nalgene ^TM，型号：3110-0500）
38.5ml离心管（Beckman Coulter，Ultra-Clear ^TM，型号：344058）
玻璃烧瓶锥形窄颈5L（Fischer Scientific，Fisherbrand ^TM，型号：11597422）
注意：此产品已由制造商撤销。 [替代物品：硼硅酸盐玻璃窄颈锥瓶（Fischer Scientific，Fisherbrand ^TM，型号：15479103）]
Waring混合器（小实验室混合器8010ES）（Scientific Labs，型号：MIX1126）
Potter-Elvehjem组织研磨机（VWR International，型号：14231-372）
馏分收集器（Gilson，型号：203B）
合适的冰箱
漏斗（玻璃或塑料，适合5 L锥形瓶）

程序

快速匀化和分离粗的色原体级分
第0天：
1. 在断路器的成熟阶段每个条件（例如，野生型和转基因番茄）收获90至150g番茄，+ 3至+ 5天。水果需要坚定。确保两种条件（WT和转基因番茄）使用相等的重量。对于胡椒果实，根据胡椒的类型和果实的颜色收获30至120g的水果。这个步骤根据水果而不同，它们是否含有高色素（类胡萝卜素）水平。在该步骤中必须小心以避免使用太多的水果，因为这将导致过量的蔗糖梯度，并且因此将不能实现清楚的分离。相反，如果没有足够的水果，则不会观察到梯度内的富集材料。建议进行多次试验，以优化实验和实验室条件所需的正确量的水果。
  注意：与橙色或黄色甜椒相比，红灯笼椒含有更高水平的颜料。所以，我们建议使用30克红椒和120克橙色或黄色甜椒。我们也使用30克红辣椒。然而，如果你正在研究高颜料或低颜料线，这些重量可能需要优化。只有通过分馏，你才会看到你的梯度是否重载（相同的颜色，没有明确的分离）。如果是这样，你将不得不使用更少的水果。相反，如果你没有看到很多颜色或没有水晶，这可能表明你没有使用足够的水果开始，你需要增加初始水果重量。
2. 用自来水或蒸馏水洗涤水果，然后进行
3. 将果皮切成片（±1cm ²）（图1）
  
  A，B，C和1,2和3表示研究的胡椒的不同种质。
4. 将它们放在塑料托盘中，用箔覆盖，在4℃过夜（以减少果实中淀粉的量）。当用含有绿色叶绿体的水果进行该程序时，这是特别重要的。还必须注意，一些突变体具有改变的成熟，因此碳水化合物水平和质地将不同。
5. 准备提取缓冲液（2 L）和梯度缓冲液（无DTT），并将其在冷室中过夜。
6. 在-20℃的室中，储存塑料容器（用于冰），八个离心管（50ml），四个离心瓶（500ml）和两个玻璃烧瓶（5L）。塑料制品可以用蒸馏水预先清洗。
7. 将离心机转子放在冰箱中过夜。
  
  第1天：
8. 在早晨（8.00 am）立即开始，打开离心机并将其冷却至4℃
9. 将转子GSA-3放在离心机RC-5C中。
10. 将玻璃烧瓶和离心瓶（500 ml）放在冰上（在冰容器中），将实验材料放在冷室中。
  注意：在寒冷的房间在以下步骤（第1天的步骤4-19）工作，尽可能在冰上一切。
11. 将水果放在搅拌机中（用蒸馏水清洗搅拌容器，然后重新用于下一个条件）。
12. 加入提取缓冲液（不要忘记从原液中加入DTT）以覆盖水果（1：3比例，水果片需要充分覆盖）（图2）。
  
  图2.均质前的提取缓冲液中的胡椒果皮
13. 让缓冲液渗入组织5分钟。
14. 使用快速爆破3秒（胡椒水果5秒）从Waring搅拌器，重复两次高速。这应该打破细胞壁，但保持完整的染色质，因为蔗糖保持恒定的渗透压（图3）。
  注意：重要的是，组织不会过度匀浆，因为这将导致破碎的质体和形成凝胶状碳水化合物颗粒物质。
  
  图3.快速匀浆后和过滤前产生的提取物
15. 使用玻璃烧瓶，漏斗和细棉布通过2至4层棉布过滤浆料。通过轻轻挤压使浆液通过细棉布（图4）。
  注意：重要的是不要施加太大的力以避免多糖材料的挤出，这将影响质体材料的造粒。
  
  图4.通过两到四层棉布过滤的提取物的表示，以创建没有碎片的提取物
16. 将番茄汁（过滤的提取物）分成两个离心瓶（500毫升）。向悬浮液中加入萃取缓冲液，直至达到瓶的2/3。结果，每种条件下产生两个500ml离心瓶（图5）
  
  图5.准备在能够沉淀粗质体级分的合适离心机中离心的提取物的实例
17. 使用顶部装载平衡小心地平衡离心机瓶。去皮第一个，第二个相当于±1克
18. 使用GSA-3转子（紫色，预冷却）在离心机（RC-5C）中以5000xg在4℃下旋转离心瓶10分钟。这一步是去除细胞碎片（上清液）（图6）注意：要操作离心机RC-5C，请检查转子是否连接良好，首先转动较大的齿轮，然后转动较小的齿轮，关闭盖子。要打开它，首先转动小齿轮，然后转动大齿轮。
  
  图6.离心前的胡椒提取物
19. 通过从颗粒的相对侧倾倒掉上清液，小心地弃去上清液
20. 将一定体积（5ml）的上清液留在罐中以便重悬沉淀（图7）
  
  图7.表示离心后从胡椒提取物获得的粗质体部分的颗粒
21. 通过旋转锅或使用附有橡胶奶嘴的玻璃棒重悬颗粒，或者对于强残余聚集体，可以使用具有切割末端的移液管。
22. 将离心瓶中的内容物转移到两个离心管（50 ml;此步骤可以根据颗粒的厚度和选区而变化，一个离心瓶的内容可以在一个离心管中转移，如果需要），然后加入提取缓冲液以填充管的体积的3/4。此时，每种条件下有四个离心管（50ml）（图8）
  
  图8. Pepper丸粒重新悬浮在提取缓冲液中，准备进行第二次离心
23. 小心平衡离心管。
24. 使用GSA-5转子（绿色）在9000×g下在4℃下用离心机RC-5C旋转管子10分钟以沉淀质体（潜在地，可以有一些核和线粒体污染）。
25. 通过从颗粒的相对侧倾倒掉上清液，小心地弃去上清液
26. 这一次，丢弃所有的上清液。颗粒应该是"丝质"包装，不允许滑脱（图9）。
  
  图9.第二次离心后获得的胡椒丸
打破色原体
1. 用3 ml的45％蔗糖梯度缓冲液重悬每个管的沉淀。可以涡旋管。倾倒并将来自相同条件的50ml离心管的染色质液汁倒入在冰上的potter-Elvehjem组织研磨机中。用0.5ml（或更多，如果需要）45％蔗糖缓冲液洗涤试管，并将其倒入陶器-Elvehjem中。
2. 使用potter-Elvehjem（约10次）均质化染色质汁以破坏色原体（视频2）。保持垂直，避免玻璃壶破裂（图10）。
  
  图10.使用potter-Elvehjem组织研磨机均匀化胡椒色素浆汁
使用蔗糖梯度分离亚溴化物隔室
1. 将一切（现在的次溴化物室悬浮液）倒入标记的Falcon管（50ml）中。保持在冰上。要洗涤陶器-Elvehjem，使用5毫升45％的缓冲液两次，并将其添加到Falcon管。
2. 在每个条件下在三个38.5ml Ultra-Clear TM离心管中制备蔗糖梯度（如果没有足够的悬浮液，则每种条件只准备两个管）。
  1. 首先向管底部加入8ml的次氯化物隔室汁（已经在45％蔗糖缓冲液中）
  2. 然后加入6ml 38％蔗糖缓冲液
  3. 然后加入6ml 20％蔗糖缓冲液
  4. 然后加入4ml 15％蔗糖缓冲液
  5. 最后，将8ml 5％蔗糖缓冲液加到梯度顶部。
  6. 在圆形运动后，将每层逐滴添加到管的内壁上，可以使用巴斯德吸管或Gilson吸管来执行此任务（视频3）。
    
    图11.超离心 ^TM 离心管在离心前在蔗糖梯度中含有番茄亚质谱支架悬浮液
3. 将38.5 ml离心管放置在其金属容器中以备离心。使用5％蔗糖缓冲液平衡它们（包括金属管的盖子），因此它们称重量完全相同。使用Beckman支架将离心管运输到Beckman L7超速离心机。
4. 将管放在SW28转子（管悬挂）。通过稍微扭转并垂直拉动，然后朝离心机外部检查其位置。
5. 在24℃以24,000rpm（100,000xg）旋转19小时。选择保持"开"，真空"开"，然后按开始。如果天平出现问题，离心机将在600 rpm左右停止。如果真空有问题，离心机将在约2,000 rpm停止
  第2天：
6. 停止离心机：按下停止按钮，当压力低时关闭真空。然后可以打开离心机盖。
7. 从转子上取下管子时要非常小心
8. 把它们放在冰上。
9. 拍摄不同梯度的照片（图12）。
  
  图12.对于胡椒的不同种质（A，B，C和1,2,3），在蔗糖梯度中分离胡椒亚质谱板区段
10. 用Gilson 203B级分收集器收集级分，泵系统（图13）。在泵系统上设置速度为24.5（或逆时针方向为-22.5），以在每个1.5ml管中收集1ml。点击时钟箭头。将针头留在空白（水）中第一分钟，然后将其放入您的管中，并在馏分收集器上开始。始终保持针在表面（刚好在半月板下面）。不要收集沉淀，在最后留下一些毫升（与沉淀混合的馏分）。当收集所有级分时，从管中取出针并置于空白（1ml）中。因此，可以取回管中的溶液。点击"停止"按钮停止泵系统，点击"结束"按钮停止馏分收集器。用移液管在另一个1.5 ml管中收集最后一毫升。
  
  图13.收集辣椒梯度。数字表示收集的级分的顺序（从Ultra-Clear ^TM离心管的顶部）。
11. 现在可以单独分析分数。
12. 将其保存在-20°C或-80°C（如果进行酶测定）

代表数据

图14.在第2天（转基因Crt B + I Ailsa Craig番茄，破碎剂+ 3至5天，150g）的蔗糖梯度的步骤5上的次溴化物区室分离。收集的每毫升称为分数（见第2天，第5点）。第一个阵营对应于从管顶部收集的第一个ml。

（2013）。的来自AC（野生型）和CrtB + I品系的色质体的亚质粒组分。从90g破碎剂+ 3至+ 5d番茄的混合物中提取色原体，然后用手持式搅拌器破碎，并以5,15,20,38和45％蔗糖（重量/体积）的不连续梯度分离。收集1ml的级分用于进一步分析。通常，每个离心管收集总共30个级分。使用来自六个重复的级分来实现图6B中所示的所有实验。使用抗体生物标记蛋白质和脂质种类的分析验证亚质粒组分。（i）蛋白质谱。分离从每个级分提取的蛋白质，并使用SDS-PAGE，然后银染色显现。所选蛋白质通过纳米LC-MS-MS鉴定：1，Plastoglobulin-1; 2，质体脂相关蛋白CHRC; 3，ATP合酶亚基b; 4，光系统I反应中心亚基II; 5，光系统II 22-kD蛋白; 6，氧放出增强蛋白1; 7，氧放出增强蛋白2; 8，热激同源70-kD蛋白-1; 9，核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基结合蛋白亚基b。这些蛋白质的鉴定的细节在附图6中在线示出。（ii）免疫印迹（I.印迹）。通过免疫印迹测定级分中生物标志物蛋白的免疫定位：通过免疫印迹测定：平滑肌蛋白（PGL，35kD），光系统II蛋白D1（PSBA，28kD），TIC（45kD），TOC（75kD）和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基（RBCL，52kD）。（iii）脂质谱。将来自级分的脂质在薄层色谱法二氧化硅板中用丙酮：甲苯：水（91:30:7）的混合物分离。脂质标准品用于鉴定：a，甘油三酯; b，一缩二甘油甘油; c，二半乳糖二甘油; d，磷脂酰乙醇胺; e，磷脂酰丝氨酸/磷脂酰胆碱;星号，污染物。 C.分离级分的超基因组分。收集后，将级分对磷酸盐缓冲液透析，然后固定在四氧化锇中。 D.分离级分的类胡萝卜素和α-生育酚含量。从每个级分中提取代谢物，并使用超高效液相色谱通过液相色谱法分离。使用标准品的校准曲线鉴定和定量类胡萝卜素和α-生育酚。内容以与管中总含量相比的分数的百分比给出。 E.在AC和CrtB + I染色质的亚质体组分内的异源八氢番茄红素合酶（CRTB，38kD）和八氢番茄红素去饱和酶（CRTI，56kD）酶和内源八氢番茄红素合酶（PSY-1,35kD）。使用特异性抗体在每个收集的级分中免疫检测这些酶。用半合子CrtB + I品系和同时对照进行实验。

笔记

水果的成熟阶段和使用的水果量对于这项工作至关重要。这里，提供了用于Ailsa Craig番茄的最佳组合（破碎器+ 3至5天和90至150g）。然而，来自不同背景的水果可以具有不同的特性（坚实度，颜料量等）。因此，有可能在获得最佳分离之前需要进行几次试验。

食谱

提取缓冲区
0.4 M蔗糖 50 mM Trizma碱基
1 mM DTT
1mM EDTA
pH = 7.8
在使用缓冲区
之前添加DTT（来自1 M储备溶液）
渐变缓冲区
45％w/v或38％或20％或15％或5％蔗糖 50 mM Tricine
2mM EDTA 2 mM DTT
5mM亚硫酸氢钠 pH = 7.9
在使用缓冲液之前添加DTT（来自1 M储备溶液）

致谢

这项工作是通过欧盟第七框架计划资助的，研究，技术开发和示范在授权协议No244348 METAPRO和No613513 DISCO。
原始质体的初始制备已在Fraser等人（1994）中报道。

参考文献

Fraser，PD，Truesdale，MR，Bird，CR，Schuch，W.and Bramley，PM（1994）。在番茄果实发育期间的类胡萝卜素生物合成（组织特异性基因表达的证据）植物生理学105（1）：405-413。
Nogueira，M.，Mora，L.，Enfissi，EM，Bramley，PM and Fraser，PD（2013）。