材料和试剂

60-mm无菌培养皿（例如，BD Biosciences，Falcon ，目录号：353002）。
注意：目前，"Corning，Falcon ^? ，目录号：353002"。
100-mm无菌培养皿（例如，Corning，目录号：430167）
注意：目前，"Corning，Falcon ^? ，目录号：430167"
50ml无菌锥形管（例如BD Biosciences，Falcon ，目录号：352070）。
注意：目前，"Corning，Falcon ^? ，目录号：352070"
5ml无菌血清移液管（例如，，Corning Costar ，目录号：4051）
小鼠（雄性和雌性，理想地在8-12周龄）
冰
重组小鼠肿瘤坏死因子（TNF）（R& D Systems，目录号：410-MT）
1x不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水（PBS）
70％乙醇
0.25％胰蛋白酶/EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup> TM，目录号：25200-056）
0.05％胰蛋白酶/EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25300）
定义的胎牛血清（FBS）（GE Healthcare，HyClone，目录号：SH30070.03）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11965-092）
青霉素 - 链霉素10,000U/ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup>，目录号：15140-122）
L-谷氨酰胺200mM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25030-081）
冲洗介质（见配方）
完整介质（见配方）
血清饥饿培养基（见配方）

设备

解剖显微镜（例如，徕卡显微系统公司，型号：MZ6）
解剖器械：镊子和剪刀
NuAire生物安全柜，II级或类似的
37℃，5％CO 2强制空气培养箱（例如Thermo Fisher Scientific，Forma TM sup），型号：3110） >
带有摆动斗式转子的离心机和适用于50 ml锥形管的适配器
CO sub 2室用于小鼠安乐死
37℃摇床水浴（例如Thermo Fisher Scientific，Precision ^TM，型号：Shaker Bath 25）
高压灭菌剃刀刀片

程序

设置男性和女性小鼠之间的定时交配
1. 检查第二天的插头。阴道塞的存在被认为是胚胎第0.5天（E0.5）。
  
  图1.在定时交配后的第二天，在雌性小鼠中识别阴道插头的存在（箭头）
2. 每2-3天监测雌性小鼠的体重增加。
3. 使用孕龄14.5-15.5的怀孕雌性小鼠注意：
  1. 雌性小鼠的妊娠通常伴随着时间的体重增加，以及明显圆形的腹部。
  2. 怀孕雌性小鼠在妊娠15.5天的体重增加范围在7.5和15.6g之间，平均体重增加11.5g。
胚胎去除和细胞分解
1. 在E14.5或15.5处对怀孕的雌性小鼠安乐死，用70％乙醇擦拭腹部，切开腹部并取出子宫，将其置于含有10ml无菌PBS的10cm培养皿中（图2A）。 br />
2. 切除子宫蜕膜，分离并将每个胚胎连同其卵黄囊一起转移到冰上用5ml PBS的新鲜60-mm培养皿中（图2B-C）。
3. 在解剖显微镜下小心地取出卵黄囊和胎盘，检查胚胎以确定活力和/或形态变化（图2D）。
  注意：我们常规检查胚胎大小，颜色（苍白，出血等），以及任何明显的结构改变，包括眼睛发育和四肢形成，以及神经系统异常，如脊柱裂和无脑畸形。这些是我们的经验中最常见的两种表现，虽然在野生型小鼠中都是罕见的。
4. 如果需要用于基因分型的DNA，用干净的剪刀剪尾注意：在此步骤中，在胚胎之间用70％乙醇清洁仪器，以避免残留污染
5. 用一对干净的镊子将头部从身体上摘下，将胚胎放在其背部，去除可见的内脏（图2D-E）。
6. 将身体放在另一个无菌的60毫米培养皿中含有0.5毫升冲洗介质在冰上，并移动到组织培养罩（图2F）。
7. 用新鲜的无菌剃刀刀片将身体切碎成尽可能细的碎片（图2G）。
8. 加入5毫升细胞培养级胰蛋白酶-EDTA（0.25％），转移到一个50ml锥形管，用移液管上下移动几次后用5ml移液管分解组织。
9. 将管放置在37℃水浴，摇动酶消化1-2小时
10. 加入另外5ml的冲洗介质，涡旋，并在室温下以1,200×g旋转5分钟。
  
  图2.用于分离MEF的程序。C-F，在解剖显微镜下捕获图像。 PL，胎盘，YS，卵黄囊，UC，脐带，IO，内脏
小鼠胚胎成纤维细胞的培养和传代
1. 为了获得用于培养的细胞，小心地将5ml吸管通过上清液，用0.5-1ml上清液吸取沉淀物（图2H，2I），并置于含有10ml完全培养基的100-mm培养皿中为每个胚胎。在培养基中上下吸取细胞以分散细胞团块。允许细胞粘附并在提供有5％CO 2的37℃培养箱中生长。这是段落0.
  注意：不要尝试使用真空吸出上清液，因为从细胞释放的DNA使得难以除去上清液而不除去细胞沉淀。成纤维细胞应在铺板后2小时内开始附着在培养皿底部。
2. 第二天更换介质。
3. 监测细胞生长。一旦细胞达到汇合（约48小时），将细胞以1:4的稀释度传递到4个新的100-mm培养皿中，用10ml PBS洗涤，用2ml的0.05％胰蛋白酶/EDTA胰蛋白酶化，并中和用8ml完全培养基。这是段1.
4. 当细胞接近汇合时（通常在48小时内）继续扩增细胞。用上述胰蛋白酶处理的传代细胞并将细胞重新平板成另外四个100mm培养皿。这是段落2.
  注意：细胞可以以1:3至1:5传代，这取决于细胞生长速率。健康初级MEF的最大传代次数约为4，因为细胞生长减缓超过传代4-5。我们通常与MEF在2-4通道工作，以获得最佳的细胞对刺激的反应。
MEF和细胞收获的刺激
1. 收集在100-mm培养皿中1-3代的汇合MEF，并以5ml培养基中2-3×10 5个细胞的初始接种密度重新接种在60-mm培养皿中每培养皿。这些细胞用于2-4代注意：几乎融合的100-mm培养皿中细胞数的估计值为约10-20×10 10个 6 个细胞。
2. 当细胞达到70-80％汇合时，在无血清DMEM中一次洗涤后，用4.5或5ml血清饥饿培养基更换培养基至少16小时。
3. 向血清饥饿培养基中加入0.5ml血清或重组鼠TNF，最终浓度为10％血清或1-10ng/ml TNF作为刺激物。
4. 然后在指定的时间点处理后收获细胞用于下游应用。对于RNA提取，在用冰冷的PBS洗涤一次后，用皿中的提取缓冲液裂解细胞。代表性数据如图1所示。

代表数据

图1.在小鼠成纤维细胞中诱导TNF-反应性基因的时间过程。和 Cxcl 使用实时RT-PCR在加入10ng/ml的TNF之后的不同时间点检查来自野生型（WT）和三四分子（TTP） - 缺陷（KO）小鼠的血清剥夺的MEF中的mRNA。显示的结果是五个独立实验的平均值±SEM，并且数据表示为相对于时间0时的WT的倍数变化;在归一化为内部对照，Actb mRNA后，将该值设置为1。表示通过配对Student t检验确定的WT和KO平均值之间的统计学差异（* P <0.05，WT对KO）。经过许可修改自Qiu em et al。（2015）。

食谱

冲洗介质
DMEM
1％青霉素 - 链霉素
完成媒介
DMEM
10％FBS
1％青霉素 - 链霉素 2mM谷氨酰胺
血清饥饿培养基
DMEM
0.5％FBS
1％青霉素 - 链霉素 2mM谷氨酰胺

致谢

该方案改编自先前发表的研究，Lai等人（2006）和Horner等人（2009），并且用于Qiu等人。（2015）。我们感谢Dee Wenzel为畜牧业提供支持，Christopher McGee为活体动物成像提供帮助，Drs。 Melissa Wells和Diana Cruz-Topete对协议的意见。这项研究由国立环境卫生科学研究所，国立卫生研究院的校内研究计划支持。

参考文献

Horner，TJ，Lai，WS，Stumpo，DJ和Blackshear，PJ（2009）。

Lai，WS，Parker，JS，Grissom，SF，Stumpo，DJ和Blackshear，PJ（2006）。通过在TTP缺陷成纤维细胞中稳定转录物的全面分析鉴定的三四脯氨酸（TTP）的新型mRNA靶标。：9196-9208。

Qiu，LQ，Lai，WS，Bradbury，A.，Zeldin，DC和Blackshear，PJ（2015）。三四脯氨酸（TTP）协调调节原发性和继发性细胞对促炎症刺激的反应。 Leukoc Biol 97（4）：723-736。