材料和试剂

消耗品
1. Microfuge管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-150-C）
2. 移液管吸头（Corning，Axygen ，目录号：T-1000-C，T-200-C，T-300）
植物材料
1. 收集推定的杂种个体的新鲜叶子以及亲本物种，并在硅胶中干燥。通常需要3-5天完全干燥叶子。
化学品
1. Taq PCR mastermix（Tiangen，目录号：KT201）
2. 液氮
3. 无水乙醇（国药集团化学试剂，目录号：10009228）（冰冷）
4. 70％乙醇（冰冷）
5. 7.5M乙酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A1542-250G）
6. 氯仿：异戊醇（24：1）（Sinopharm Chemical Reagent，目录号：氯仿，10006818;异戊醇，10003218）
7. ddH 2 O（无菌）
8. 5x装载缓冲液，使用GelRed（Shanghai Generay Biotech，目录号：GR0205-500）
9. 十六烷基三甲基溴化铵/十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）（Thermo Fisher Scientific，目录号：ICN19400480）
10. 乙二胺四乙酸（0.5M溶液/pH 8.0）（EDTA）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP2482-500）
11. 聚乙烯吡咯烷酮，MW 40,000（PVP 40）
12. NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S5886-500G）
13. HCl（Sigma-Aldrich，目录号：258148）
14. Tris碱（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP152-1）
15. 硼酸（Sigma-Aldrich，目录号：B0394-100G）
16. 琼脂糖（Biowest，目录号：111860）
17. Hi-Di TM甲酰胺（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^TM，目录号：4311320）
18. GeneScan 500Liz（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^TM，目录号：4322682）
19. CTAB缓冲区（请参阅配方）
20. 1 M Tris（pH 8.0）（参见配方）
21. TE缓冲区（参见配方）
22. 5x TBE（Tris-硼酸盐-EDTA）缓冲液（储液）（见配方）
23. 1％琼脂糖凝胶（见配方）

设备

砂浆和杵
微量离心机（Eppendorf，型号：5427R）
水浴（IKA，型号：HB10）
PCR热循环仪（EASTWIN，型号：ETC-811）
琼脂糖凝胶电泳系统[包括用于电泳的PowerPac TM基本电源（Bio-Rad Laboratories，目录号：1645050）]
遗传分析仪（Invitrogen，型号：ABI PRISM 3100）

软件

GeneMarker版本2.4.0（ http://www.softgenetics.com/GeneMarker。 html ）
FSTAT版本2.9.3（ http：//www2.unil。 ch/popgen/softwares/fstat.htm ）
GenAlEx 6.2版（ http：//biology-assets。 anu.edu.au/GenAlEx/Download.html ）
STRUCTURE版本2.2（ http://pritchardlab.stanford.edu/software/structure2_2.html ）
NewHybrids版本1.1测试版（ http： //ib.berkeley.edu/labs/slatkin/eriq/software/software.htm#NewHybs ）

程序

DNA提取和聚合酶链反应使用改进的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）方法（Doyle，1991）提取总DNA。由Duan和Zhang（2014）（AC30，CT12，CT59，CT113，CT17，CT60，CT48，CT135，CT142，CT91）从M开发的十对SSR标记。 pubescens 用于测试M之间的基因流。 pubescens var。和 M。 kwangtungensis 。每个引物对的正向用荧光染料（FAM，HEX，ROX，TAMRA）标记。引物的信息如表1所示
表1.本研究中使用的10对SSR引物的特征针对每个基因座呈现的是正向（F）和反向（R）引物序列，重复基序，原始片段的大小bp），退火温度（℃）和GenBank登录号。 Td，触地。

DNA扩增在10μl反应混合物中进行：
5μlTaq PCR主混合物
0.2μM的每条引物
3.6μlddH 2 O 2/d 20-40 ng基因组DNA
扩增条件如下：
1. 94℃，4分钟（初始变性）
2. 94℃，30秒（变性）
3. 60℃，30秒（退火）
4. 72℃，30秒（延伸）
  从步骤（b）到（d）的7个循环
5. 94℃，30秒（变性）
6. 53℃，30秒（退火）
7. 72℃，30秒（延伸）
  从步骤（e）到（g）的28个循环
8. 72℃，10分钟（最终延伸）
9. 保持样品在4℃直到进一步处理
PCR产物在Sangon Biotech（上海）有限公司的ABI PRISM 3100遗传分析仪上测定，1μl产物（10倍稀释）与15μlHi-Di ^{TM >甲酰胺探针，其包括2％GeneScan 500Liz。使用GeneMarker版本2.4.0软件收集扩增的SSR片段数据。}
数据分析
软件FSTAT 2.9.3（Goudet，2001）和GenAlEx 6.2（Peakall和Smouse，2006）分别用于计算等位基因和私有等位基因。我们使用了程序STRUCTURE 2.2（Pritchard等人，2000; Falush 等人）用于群体遗传结构分析和杂交检测。该方法实现了基于贝叶斯模型的聚类方法。我们认为所有的轨迹是独立的，遵循Hardy-Weinberg平衡和连接平衡。该程序对于每个K值运行10次，范围为1-5，对于老化和40,000次迭代具有100,000次重复。在k = 2的五个运行中，选择具有最高似然值的运行以分配后验成员系数（Evanno等人，2005）。
整个数据集被布置为单个文件中的矩阵，其中个体的数据在行中，并且轨迹在列中。对于二倍体生物体，每个个体的数据可以作为2个连续行存储，其中每个基因座在一个列中，或在一个行中，其中每个基因座在两个连续列中。缺少的数据应由数据中未出现的数字表示。
使用软件NewHybrids版本1.1β（Anderson和Thompson，2002）来鉴定所采样的个体中的杂种。该程序计算落入六个基因型类别（亲本1，亲本2，F1杂种，F2杂种，向亲本1的回交世代和亲本2的回交世代）中的每一个的后验概率。对于FSTAT，GenAlex和NewHybrids，我们在每个软件中使用默认值。对于STRUCTURE，我们选择混合模型，并设置我们在原始文章（Luo等人。，2015）中提及的参数，其他参数我们使用默认值。

代表数据

数据的代表性示例可以在我们公开的工作中找到（Luo等人，2015）。图1显示了基于程序NewHybrids和STRUCTURE使用SSR数据的所有采样个体的基因型分类分析。

图1.基于使用SSR数据的程序NewHybrids（A）和STRUCTURE（B）的所有样本个体的基因型类分析 A.新的Hybrids计算落入六个基因型类别中的每一个的后验概率：P1 （亲本1），P2（亲本2），F1（F1杂交体），F2（F2杂交体），BC1（与亲本1的回交代），BC2 B.基于13个SSR基因座（K = 2）的81个种质的结构。每个条表示一个个体，P1 = M。 kwangtungensis ，P2 = em。 pubescens var。。

食谱

CTAB缓冲液，100ml
2.0 g CTAB
10.0ml 1M Tris（pH8.0） 4.0ml 0.5M EDTA（pH8.0）
28.0ml 5M NaCl
40.0ml H 2 O v/v 1 g PVP 40
将所有pH调节至8.0并用ddH 2 O补足至100ml
1M Tris pH 8.0,1L
121.1克Tris
700ml ddH 2 O
将Tris溶解在ddH 2 O中并使其达到900ml 通过加入40-50ml浓HCl将pH调节至8.0
TE缓冲液100ml，
10mM 1ml 1M Tris（pH8.0） 1mM 0.2ml 0.5M EDTA
5x TBE（Tris-硼酸盐-EDTA）缓冲液（储液）
54克Tris碱
27.5克硼酸 20ml 0.5M EDTA（pH8.0）用HCl调节pH至8.3 在使用电泳之前，该储备溶液可稀释至1x
1％琼脂糖凝胶将1g琼脂糖溶解在100ml 1x TBE中

致谢

这项工作得到国家自然科学基金（31000109,31370269,31170184，U1202261）和国际科学基金会（AD/22476）的支持。该协议是从我们以前的工作中修改的，Luo，ZL，Duan，TT，Yuan，S.，Chen，S.，Bai，XF和Zhang，DX（2015）Reproductive isolation between sympies sister species，/em> kwangtungensis 和 M。 pubescens var。。 J Integr Plant Biol 57：859-870。

参考文献

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Falush，D.，Stephens，M.和Pritchard，JK（2003）。使用多基因基因型数据的群体结构推断：连锁基因座和相关等位基因频率。遗传学164（4）：1567-1587。

Falush，D.，Stephens，M。和Pritchard，JK（2007）。使用多基因基因型数据推导群体结构：显性标记和无效等位基因。 7：574-578。

Goudet，J。（2001）。 FSTAT，用于估计和测试基因多样性和固定指数的程序（2.9.3版）（从Goudet，J。（1995）。FSTAT（1.2版）更新：计算F-统计的计算机程序J.Hered.86 ：485-486）。可在以下网址获取： http://www.unil.ch /izea/softwares/fstat.html。

Lua，ZL，Duan，TT，Yuan，S.，Chen，S.，Bai，XF，and Zhang，DX（2015）同生姊妹物种，Mussaenda kwangtungensis和 M之间的生殖隔离。 pubescens var。 J Integr Plant Biol 57：859-870。

Peakall，R。和Smouse，PE（2012）。 GenAlEx 6.5：Excel中的遗传分析。用于教学和研究的群体遗传学软件 - 更新。生物信息学28（19）：2537-2539。

Pritchard，J.，Stephens，M.，and Donnelly，P.（2000）。使用多位点基因型数据推断群体结构。 155：945-959

Shaw，J.，Lickey，EB，Schilling，EE and Small，RL（2007）。比较整个叶绿体基因组序列以选择非编码区域用于被子植物中的系统发育研究：龟和野兔III.The Am J Bot 94（3）： 275-288。