第一部分。Islet隔离

材料和试剂

50ml聚丙烯锥形管（Corning，Falcon ，目录号：352070）
0.2微米注射器过滤器（例如Sartorius AG，目录号：16534-k）
注射器（体积依赖于制备的胶原酶P的体积）
冰
2ml滑动尖端注射器（将保持总体积3ml）（BD，目录号：302204）
30G×1/2英寸针（BD，目录号：305106）
500微米筛（Sefar Pty Ltd.，目录号：06-500/38）注意：切成大约5厘米的方块，并高压灭菌（图1）（见替代产品说明）

图1. Sefar Pty有限公司生产的500μm胰岛网和规格参考号为
的50ml管盖
胶原酶P（Roche Diagnostics，目录号：11213865001）
注意：它需要在使用前进行测试和优化（见注1）。
RPMI 1640培养基（Life Technologies，Gibco，目录号：21870-076）注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：21870-076"
Histopaque-1077（Sigma-Aldrich，目录号：H8889）
Hanks平衡盐溶液（HBSS）（Life Technologies，Gibco，目录号：14175-079）
注意：目前，是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：14175-079"
氯化钙脱水物（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C5080）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375-100G）
HBSS/Ca/HEPES（参见配方）

设备

冰盒
解剖显微镜[例如，立体变焦显微镜（尼康仪器公司，型号：SMZ745）]
光纤光源（例如，AmScope Dual Goose-neck Fiber-Optic Illuminator，型号：HL150-AY）
钳子[例如，Graefe镊子，100mm，弯曲（ProSciTech Pty Ltd.，目录号：T131C-2）]
剪刀[例如，Iris scissors，115mm，straight（ProSciTech Pty Ltd.，目录号：T097-2）]
夹子[例如，直径150毫米的斯宾塞镊子（ProSciTech Pty Ltd.，目录号：T124）]
台式离心机在室温下，不需要制动（例如，Thermo Fisher Scientific，Heraeus ^TM，型号：Multifuge X1R）

程序

测量每胰腺HBSS/Ca/HEPES 5ml到50ml管中。
每管胰腺胰腺测量5ml到50ml管中测量10ml胰腺Histopaque到50ml管中。如果需要超过50毫升，请使用多个试管，但要将内容物均匀地涂抹在试管上
将所有培养基置于37℃水浴中
称量足够的胶原酶P，以在特定浓度下为每批胶原酶P制备3ml（参见注释1-3）。将称重的胶原酶P置于50ml管中
将胶原酶P溶解在冷（4℃）HBSS/Ca/HEPES溶液中。加入所需体积的HBSS/Ca/HEPES到含有称重的胶原酶P的50ml管中，并轻轻倒转2-3次。静置1-2分钟，然后使用0.2μm过滤器和注射器灭菌。从此时起，将胶原酶P溶液保持在冰上。
将3毫升胶原酶P放入2毫升滑头注射器，并附上一个30 G针。保持填充注射器在冰上。排出液体过多时，不要使用带有LuerLok的注射器作为压力，否则胆管会撕裂。
有关如何执行胆管注射程序的详细信息，请查看视频1。简而言之，打开鼠标腹腔，沿肋骨线水平切开腹膜壁，并用小直剪刀垂直切开。将组织放在鼠标的上半身，组织边缘在肋线上。用手指轻轻按下鼠标身体的两侧，使肝脏暴露在肋骨线下方。将肝脏翻转到组织上并将组织折叠以覆盖它。用少量乙醇润湿，轻轻按下以保持一切就位。

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视频1.胆管注射和胰腺解剖

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将鼠标放置在解剖显微镜下，并使用弯钳镊子暴露十二指肠，并找到胆管结束十二指肠的地方（见视频1和图2）。夹住胆管进入十二指肠，并将夹子旋转到鼠标的后部，使胆管张紧。使用小的弯曲镊子在与肝脏的连接处保持胆管，并轻轻地将30G针插入导管。轻轻注入3毫升胶原酶P胆囊充气胰腺（见视频1，图2和注4）。

图2.通过胆管注射胶原酶P. 使用30 G针头（B-C）将夹子施加到胆管，进入十二指肠（A），胶原酶P溶液通过胆管注射。的灌注的胰腺在注射胶原酶P时肿胀
轻轻地解剖膨胀的胰腺，小心不要切割胃或肠或其他腹部器官，并放入空的50毫升管。保持在冰上。对其他动物重复步骤6-8。
当所有胰腺已经切除时，将温热的HBSS/Ca/HEPES加入管中至总体积为5ml /胰腺，并置于37℃的水浴中。在胶原酶P和小鼠品系的批次之间孵育时间不同（参见注释1和5）
当胰腺置于水浴中时，从37°C水浴中取出准备好的Histopaque管和RPMI管。在胶原酶P消化培养期间，这些应该冷却至室温
从水浴中取出胰腺管，立即置于冰水（冰水）中。不要旋转，摇动或干扰沉降的组织
立即和尽快工作，尽可能多的温暖HBSS/Ca/HEPES和胶原酶P混合关闭每个胰腺，而不从管中删除胰腺。用冰冷的HBSS/Ca/HEPES将每管加热至15ml。这一步骤通过快速冷却胰腺来停止消化过程。
通过用每分钟3次振荡的速率剧烈地手动摇动管1分钟来中断胰腺。保持管直立，让胰腺击中管的顶部和底部（见视频2）。不要倒置管。将管子放在冰上。

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视频2.通过剧烈颤抖中断胰腺

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将一个高压灭菌的500微米网格的正方形在新的50ml管（每个胰腺一个）的顶部，并用少量（1-2ml）冷RPMI润湿网。将消化的胰腺通过网格。用30 ml冷RPMI从其原来的管洗剩余的胰腺，并通过网倒入。盖上收集管，并返回到冰。请注意，一些未消化的组织可能保留在网格的顶部。与其他样品重复。
允许消化的胰腺在冰上通过重力放置在50ml管中10分钟
吸出上清液使用25毫升移液管，留下10-15毫升。小心不要破坏消化的组织。用RPMI补充消化的胰腺管至总体积为30ml，轻轻颠倒2-3次混合。
在室温下以215×g离心管离心2分钟
轻轻倒出上清液，小心不要取出沉淀。将管倒置在纸巾上，使残留的介质排出。重要的是去除所有培养基，以使Histopaque不被稀释
轻轻地球团以松开消化的胰腺。管从这一点应该保持在室温。所有试剂和离心步骤应在室温（22℃）
每管加入10ml Histopaque（必须在室温下）。轻轻旋转以获得均匀分布的消化胰腺。如果有团块，轻轻地用吸管将它们分开。避免剧烈吸液。
用5ml RPMI（必须在室温）覆盖每个Histopaque梯度。确保界面清晰，因为这是离心后胰岛所在的位置
在制动器关闭的情况下，在22℃下以850×g离心15分钟
轻轻地使用塑料移液管从梯度中删除胰岛。胰岛将在RPMI和Histopaque的界面下方的环中可见（参见图3）。根据需要去除尽可能多的RPMI和Histopaque以去除胰岛而不干扰沉淀。如果具有免疫细胞浸润的胰岛从NOD小鼠中分离，请参见注释6，了解胰岛从梯度中的位置和去除的详细信息。

图3.胰岛在Histopaque/RPMI梯度界面处的位置。A.正常胰岛的示意图和照片，正好在Histopaque/RPMI界面下形成环。 B.来自扩散通过Histopaque的NOD小鼠的渗透胰岛的示意图和照片。示意图显示用于从梯度收获胰岛的移液管
将胰岛转移到含有30ml RPMI（室温）的新的50ml管中
在室温下以215×g离心2分钟
轻轻倒出上清液，并在纸巾上吸干管。此时，胰岛可以培养或胰蛋白酶化为单细胞

第二部分。完整整个胰岛的培养

材料和试剂

94×15mm培养皿（Greiner Bio One International GmbH，目录号：633185）
FCS
谷氨酰胺
青霉素
链霉素
CMRL Medium，无谷氨酰胺（Life Technologies，Gibco，目录号：11530-037）（参见配方）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：11530-037"
完成CMRL（参见配方）

设备

在37℃，5％CO 2，相对湿度环境至80％[例如，系列II 3110水夹套CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Forma TM，型号：3131）]

程序

轻轻冲洗胰岛沉淀轻轻重悬，然后加入5毫升温的完全CMRL
通过倾吐转移胰岛到培养皿。不要使用组织培养皿，因为胰岛会粘附。
通过用另外5ml的温的完全CMRL洗涤管来移除残余的胰岛，并将其倒入培养皿中。不要将超过10毫升的培养基放入94毫米的培养皿中，以确保对缺氧高度敏感的胰岛有足够的氧合。
确保胰岛在培养皿中扩散并将培养皿置于37℃的5％CO 2培养箱中。允许胰岛恢复0.5-1 h，然后进一步操作。
在具有外部光源的解剖显微镜下，使用无菌的200μl移液管尖端将胰岛移植到管或培养皿中以进行进一步分析（参见图4）。
胰岛可以在37℃+ 5％CO 2下培养最多三天。

图4.孤立的胰岛在体外培养中的挑选
胰岛产量在小鼠品系之间不同。来自C57Bl/6小鼠的预期产量为300-400个胰岛，而来自非肥胖糖尿病（NOD）小鼠的预期产量为150-300个胰岛，这取决于小鼠的年龄（参见注释6）。

第三部分。将胰岛胰蛋白酶化为单个细胞

材料和试剂

1 ml Gilson移液器
0.2微米注射器过滤器（例如Sartorius AG，目录号：16534-k）
FCS
谷氨酰胺
青霉素
链霉素
Dulbecco磷酸盐缓冲盐水
牛胰蛋白酶
EDTA
CMRL Medium，无谷氨酰胺（Life Technologies，Gibco，目录号：11530-037）（参见配方）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：11530-037"
完成CMRL 1066（请参阅配方）
胰岛素胰蛋白酶（见配方）

设备

37℃水浴（，例如，Ratek Instruments，型号：WB14）
在37℃，5％CO 2，相对湿度环境至80％[例如，系列II 3110水夹套CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Forma TM sup），型号：3131）]

程序

请查看视频3胰岛素胰蛋白酶消化。
向胰岛丸中加入300μl胰蛋白酶。
在37℃在水浴中孵育5分钟。
用1ml Gilson移液管吸取胰岛上下10次。胰岛应该分散，这可以可视化。请参阅视频3.
加入3-5ml完全CMRL以停止胰蛋白酶反应
以305×g离心5分钟以沉淀单细胞
倒出介质，更换为1ml完整的CMRL
在37℃，5％CO 2培养箱中孵育含有胰蛋白酶化胰岛的管1-2小时，以允许在进一步实验/分析之前回收细胞。

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视频3.胰岛对单细胞的胰蛋白酶消化

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笔记

每个酶批号的胶原酶P活性存在显着变化。该变化改变了所用的浓度和消化的时间。理想的酶批次应该具有1.6-2.2U/mg的胶原酶P活性，以在0.3mg/ml-0.55mg/ml的浓度范围和15-17分钟的孵育时间使用。胶原酶活性和胰蛋白酶活性之间的平衡也广泛变化并且为了有效的胰岛分离重要的是胰蛋白酶活性不是太高。在2.63-4.3U/mg范围内的胰蛋白酶活性提供最佳结果。胰蛋白酶活性必须< 5 U/mg 当购买新批号的胶原酶P进行彻底测试，包括滴定浓度和孵育时间
胶原酶P应在达到室温前称重，以防止冷凝和损坏产品。如果购买大量的产品，在新瓶子中少量放入一个"工作批次"，以免丢失整个库存的活动。
在称量胶原酶P时，请戴上口罩和手套，因为它既是呼吸道刺激物又是皮肤刺激物
胆管的长度和脆性随不同的小鼠品系而变化。 C57Bl/6和遗传衍生物比其他菌株具有更短和更脆弱的胆管。在夹紧和将针插入导管时非常小心，并缓慢注射胶原酶P溶液。肥胖糖尿病小鼠模型Lepr ^db/db中的胆管非常脆弱，需要特别小心。
上述方案可用于从任何小鼠品系中分离胰岛，然而，根据使用的菌株，消化温育时间有轻微的变化。 C57Bl/6胰岛比Balb/C或NOD小鼠胰岛更易于过度消化，C57Bl/6小鼠的孵育时间和该菌株的遗传变异应总是减少约1分钟。
NOD小鼠是1型糖尿病的动物模型，其在大约4周龄开始由免疫细胞进行胰岛的渐进性浸润（Graham等人，2012）。免疫细胞的存在改变胰岛在密度梯度内的位置。含有免疫细胞的胰岛将扩散并出现在Histopaque/RPMI界面下方（参见图3）。 NOD小鼠中胰岛的免疫介导的破坏也降低了老龄小鼠的胰岛产量
细胞过滤器，例如pluriSelect的500μl的PluriStrainer（ https://www.pluriselect.com/product-details/product/pluristrainer-500-um-cell-strainer.html ）可用作500μm网格的替代品用于胰岛分离过程的第I部分。但这些都没有在我们的实验室测试。

食谱

HBSS/Ca/HEPES
1L Hanks平衡盐溶液（HBSS）
2mM CaCl 2 2 / 20 mM HEPES
将所有试剂混合在无菌生物安全柜中
储存在4°C
完成CMRL
500 ml CMRL 1066
10％FCS
2mM谷氨酰胺 100 U/ml青霉素
100μg/ml链霉素将所有试剂混合在无菌生物安全柜中
储存在4°C
胰岛素胰蛋白酶
50ml Dulbecco磷酸盐缓冲盐水
5.16mg牛胰蛋白酶
20mM EDTA（0.2ml 0.5M EDTA）结合所有成分
通过0.2μm注射器过滤器灭菌
等分并保存在-20°C

致谢

该协议自我们的实验室的成员自第一次公布以来已经开发和改进（Chong等人，2004; Liu和Shapiro，1995; Thomas等人， 1998）。我们承认该小组所有为这一过程做出贡献的成员。我们常规地在我们对小鼠模型中1型和2型糖尿病的发病机理的研究中利用该方案（Chee等人，2014; Graham等人，2011; Quah等人，2014; Wali等人，2014; Zhao等人，2015）。这项工作由澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）计划资助（APP1037321）和与HET的伙伴关系（APP1042735）资助。圣文森特学院获得维多利亚州政府的运营基础设施支持计划的支持。

参考文献

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