材料和试剂

parafilm
剃刀刀片
组织培养管（标准15或50ml锥形TC管）
带25 G针的5 ml注射器
细胞过滤器（70μm）（Corning，目录号：352350）
细胞培养96孔板
组织培养皿
Whatman滤纸（Sigma-Aldrich，目录号：WHA10347509）
6-至10周龄的小鼠
磷酸盐缓冲盐水（PBS），灭菌，pH 7.4（Thermo Fisher Scientific，目录号：10010023）
Dulbecco改良的Eagle培养基，高葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11965092）
青霉素/链霉素（10,000U/ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140-122）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：16000044）
MEMα，核苷（Thermo Fisher Scientific，目录号：12571-063）
巨噬细胞刺激因子（M-CSF）（PeproTech，目录号：315-02）和受体激活的核因子k-B配体（RANKL）（PeproTech，目录号：315-11）
牛股骨（来自肉类市场）
乙醇
戊二醛（Sigma-Aldrich，目录号：G5882）
甲苯胺蓝（Sigma-Aldrich，目录号：T3260-5G）
MilliQ水
酸性磷酸酶，白细胞（TRAP）试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：387A-1KT）
硼酸钠10水合物（Fisher Scientific，目录号：02-003-999）
台盼蓝（Thermo Fisher Scientific，目录号：T6146-5G）
氯化铵（NH 4 Cl）（Sigma-Aldrich，目录号：A9434-500G）
盐酸盐（Tris-HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：T5941-100G）
红细胞（RBC）裂解缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：R7757）（参见配方）
破骨细胞前体培养基（参见配方）
破骨细胞分化培养基（参见配方）
1％甲苯胺蓝（见配方）
戊二醛溶液（见配方）

设备

镊子剪刀
钢锯
Scalpel
水超声仪
Isomet低速锯（BUEHLER，目录号：111280），带有切片刀片
光学显微镜

程序

制备骨切片
注意：如果您有预制的骨切片，请跳至步骤B.
1. 将牛股骨的骨干横向切割成具有钢锯的2-3cm圆柱体，如图1A所示。
2. 将圆柱体切成三段，将骨髓提起，如图1B所示。任何粘连的肌肉，骨髓或骨膜用手术刀清除
  
  图1.牛股骨的横切和节段切割图。 A。牛股骨的图像，其描绘横向切成2-3cm圆柱体的骨干部分; B.（A）中提到的揉合圆柱体进一步被切成如图所示的三段（箭头）
3. 然后用温和的水用少量洗涤剂将该片段超声处理几次，直到骨头是干净的。重复两到三次，直到骨头清洁。在原始实验中，将区段在50-60Hz下超声处理2分钟。
4. 骨髓段用手术刀最终清洁任何粘附的组织，包裹在石蜡膜中并在冷冻条件（-20℃）下储存。来自相同圆柱体的段被给予相同的标签。
5. 为了做出4.4×4.4×0.2mm的骨切片，用Isomet低速锯用晶片刀片将骨段横向切割成200μm厚的块。这些200微米切片用于生产最终的4.4 x 4.4 x 0.2毫米的骨切片
6. 然后夹住200μm切片的叠层，并制成条带为4.4mm宽的切片。
  然后将骨片堆叠以90度夹紧到夹具，并通过以4.4mm的间隔切割产生最终的骨切片。这些骨段的切割最终导致产生4.4×4.4×0.2mm的骨切片/>
7. 将骨切片存储在70％乙醇中，直到使用。
制备骨髓衍生的破骨细胞前体
1. 在无菌条件下从6至10周龄小鼠解剖股骨和胫骨，并将其置于冷PBS中。用镊子剪刀和剃须刀刀片清除所有软组织，例如肌肉，脂肪，等。
2. 用无菌PBS清洗股骨和胫骨两次，切两端
3. 用5ml注射器（25G针）和DMEM（补充P/S和1％FBS）从两端将骨髓细胞冲洗到组织培养管（标准15或50ml锥形TC管）中。需要约40ml DMEM（补充有P/S和1％FBS）冲洗骨髓细胞。
4. 通过在室温下离心637×g 5分钟来沉淀骨髓细胞并弃去上清液;在室温下将细胞重悬浮于3ml红细胞（RBC）裂解缓冲液中3-4分钟以破坏红细胞。
5. 向细胞中加入7mlαMEM培养基（含10％FBS）以中和RBC缓冲液的作用;将细胞通过一个70微米的细胞过滤器进入一个50ml锥形管
6. 通过在室温下离心637×g 5分钟来沉淀细胞并弃去上清液;用10 ml无菌PBS洗涤细胞一次，计数细胞数
7. 将5×10 5个细胞/ml的细胞再悬浮于补充有20ng/ml M-CSF的完全αMEM培养基中。
8. 在5％CO 2和37℃下培养细胞过夜。收集非贴壁细胞并计数其数量并丢弃贴壁细胞（大多数是成纤维细胞，成熟巨噬细胞和基质细胞）。非粘附细胞的预期产量为5×10 6个细胞/ml。
9. 对于坑测定，如步骤A6中所述，用骨切片孵育细胞
骨吸收坑测定
1. 在实验前一天，在无菌罩中用紫外线标记骨切片并将其消毒
2. 在实验当天，将骨切片置于96孔（1切片/孔）标记面朝下。准备骨髓细胞和板在50,000细胞/孔或适当的细胞数量，并在200微升的破骨细胞分化培养基在井中培养。
3. 将细胞培养10-14天，每2-3天喂养一次。培养基必须在每次喂养期间完全补充。
4. 然后将骨切片用2.5％戊二醛的PBS溶液在室温下固定30分钟
5. TRAP（Sidqui等人，1995）染色细胞并显微镜检查以观察TRAP（+）破骨细胞。
  图2显示了来自8周龄雄性小鼠的胫骨切片的TRAP染色的实例。三个红色箭头指向TRAP +破骨细胞（其染成红色）。单个TRAP +破骨细胞的放大图像显示在右上角。
  
  图2.在8周龄雄性小鼠的胫骨部分上TRAP阳性的破骨细胞的图像。来自8周龄小鼠的胫骨切片用TRAP染色，并用苏木精蓝复染。多核破骨细胞出现在小梁骨表面上的红色（箭头）。该代表性实例取自"FASEB Journal（Zhou等人，2015）"中公开的"SHP2通过促进成骨细胞前体融合来调节破骨细胞形成"。
6. 通过在50-60Hz的蒸馏水中超声处理5-15分钟从骨切片中去除细胞从骨切片中去除细胞。
  注意：在玻璃烧杯中单独超声处理骨切片，以防止识别号码脱落时的骨切片错误识别。
7. 在染色前重新对骨切片重新编号，并在Whatman滤纸上完全干燥骨。
8. 在实验前一天准备1％甲苯胺蓝。
9. 在1％硼酸钠中的1％甲苯胺蓝上染色骨总共4分钟。通过将微滴（20μl）的染色剂置于培养皿上而染色。小心地将骨切片放置在液滴的一侧，使切片倾斜到染色剂的表面上，而不是浸没在液滴的表面下。换句话说，骨切片不应该破坏液滴的表面张力并且被液滴浸没;一旦放置在液滴表面上的倾斜位置，它应该保留在液滴的表面上步骤C9的结果的两个图像显示在下面的图3中。在每个图像中，骨切片倾向于在1％硼酸钠液滴中的1％甲苯胺蓝。每张图片中的骨切片不浸没在1％甲苯胺蓝的1％硼酸钠液滴中。
  
  图3.骨切片在甲苯胺染色上的适当位置的说明性实例。在显微镜载玻片上吸取甲苯胺染色液滴。使用镊子，将骨切片置于甲苯胺染色剂的表面上。如图3所示，骨切片的适当构型在甲苯胺染色液滴的表面上
10. 从液滴染色去除骨切片，并通过旋转骨切片在蒸馏水中冲洗。空气干燥并用光学显微镜检查。
  1. 使用Olympus示波器，打开左侧方框的光源，使光源来自示波器的顶部。
11. 在显微镜下拍照并评估凹坑形成的数量和大小注意：坑应该用甲苯胺的颜色染色。

代表数据

以下三个代表性例子来自Zhou等人（2015）。

图4.坑测定的阳性结果的说明性实施例上述的坑测定实验在与破骨细胞共培养的牙本质切片上进行体外10天。在不添加外来SHP2抑制剂的情况下产生4A和4B中的测定结果。然而，在4C中，在共培养过程期间，用NSC-87877抑制SHP2以阻断成熟破骨细胞形成（Zhou等人，2015）。因此，诱导缺乏成熟的破骨细胞，这导致缺乏如在4C中所示的吸收凹陷。比例尺，100μm。

由坑测定程序产生的"坑"是图4A，图4B和图4C中的蓝色区域。图4A，4B和4C中的红色箭头指向所创建的凹坑。蓝色染色是由于在该过程中使用的甲苯胺蓝。图4A和4B中表示的样本都具有相当大量的凹坑。图4C中所示的样品具有相对缺乏凹坑在原始实验中使用的小鼠品系是C57BL/6品系。

食谱

RBC裂解缓冲液
0.747％NH 4 Cl
0.017％Tris-HCl
破骨细胞前体培养基
补充有1％青霉素/链霉素（P/S），10％FBS（热灭活的）和20ng/ml M-CSF的αMEM。
破骨细胞分化培养基
补充有100ng/ml RANKL的破骨细胞前体培养基
1％甲苯胺蓝
通过在100ml dH 2 O中混合1g硼酸钠10水合物制备1％甲苯胺蓝。
在该溶液中溶解1克甲苯胺蓝，并使其静置过夜
使用Whatman滤纸过滤染色溶液并在室温下贮存
戊二醛溶液
戊二醛溶液在H 2 O中的浓度为25％使用时用ddH 2 O稀释至2.5％

致谢

该协议改编自以前发表的论文Zhou等人。（2015）。这项工作部分由美国国家卫生研究院（NIH）国家关节炎和肌肉骨骼和皮肤疾病研究所授予R21AR57156（W.Y.）和NIH国家综合医学科学研究所Grant P20 GM103468部分支持。本研究还得到了北美儿科骨科学会和骨科研究与教育基金会（授予WY）和美国农业研究部服务计划授予＃5450-51000-046-00D（授予JC）的资助，。

参考文献

Cao，J.，Wu，Q.，Qin，YX，Reginato，AM，Ehrlich，MG和Yang，W.（2015）。 SHP2通过促进preosteoclast融合来调节破骨细胞发生。 29（5）：1635-1645。

Charles，J.F.和Aliprantis，A.O。（2014）。破骨细胞：超过"骨吃药者"。 20（8）：449-459。

Ross，F.P。（2006）。 M-CSF，c-Fms和破骨细胞及其前体中的信号传导。 1068：110-116。

Sidqui，M.，Collin，P.，Vitte，C.and Forest，N.（1995）。分离的破骨细胞对硫酸钙半水合物的成骨细胞粘附和吸收活性。生物材料16（17）：1327-1332。

Teitelbaum，SL（2000）。破骨细胞骨吸收。科学 289（5484）：1504-1508。

Zhou，Y.，Mohan，A.，Moore，DC，Lin，L.，Zhou，FL，Cao，J.，Wu，Q.，Qin，YX，Reginato，AM，Ehrlich，MGand Yang， 2015）。 SHP2通过促进preosteoclast融合来调节破骨细胞发生。/a> FASEB J 29（5）：1635-1645。