材料和试剂

真空驱动的Sterilcup 500ml Millipore ExpressPLUS0.22μmPES（Merck Millipore Corporation，目录号：SCGPU05RE）
FastPrep 管（MP Biomedicals，目录号：5076-400）
¼"陶瓷球（MP Biomedicals LLC，目录号：116540412）
用于冷冻病毒的CryoTubes TM sup/TM小瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：377267）
外科剪刀（Roboz Surgical Instrument Co）
镊子（Roboz外科手术器械公司）
384孔PCR板（VWR International，目录号：82051-470）
PCR条管，0.2ml（Bioexpress，目录号：T-3035-2）
用于移液管助剂（VWR International，目录号：28145-481）中的0.22μm过滤器
BSL2个人防护装备（PPE）
小鼠（Balb/c，6-8周龄，性别混合）（Taconic）
人RSV株A2（ATCC，目录号：VR-1540）
SYBR绿主混合物（Applied Biosystems，目录号：4368708）

qPCR引物组

基因	正向引号	反向引号
RSV g	5'AACATACCTGCCCAGAATC3'	5'GGTCTTGACTGTTGTAGATTGCA3'
Rsp11	5'CGTGACGAAGATGAAGATGC3'	5'GCACATTGAATCGCACAGTC3'
微管蛋白	5'TGCCTTTGTGCACTGGTATG3'	5'CTGGAGCAGTTTGACGACAC3'

RSV基因组RT引物：5'GATAAATATAGGCATGGGGAAAGTG3'
TRIzol试剂（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：15596018）
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：C2432-25ml）
异丙醇（Sigma-Aldrich，目录号：437522）
注意：在Sigma-Aldrich网站上也称为"2-丙醇"。
超纯无核酸酶水
SuperScript III第一链合成系统（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：18080-051）
高容量RNA-to-cDNA 试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^TM，目录号：4387406）
氯胺酮（Henry Schein）
赛拉嗪（美国食品和药物管理局，AnaSed，目录号：139-236）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10010-023）
氯胺酮/赛拉嗪溶液（参见配方）
底漆准备（见配方）

设备

生物安全2级生物安全罩
Applied Biosystem ViiA TM supra TM lightcycler（Life Technologies，目录号：4453536）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，目录号：4453536"。
Eppendorf离心机5415R（Eppendorf AG，目录号：22636570）注意：此产品已由Eppendorf AG停产。
NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，目录号：ND-1000）
BioRad C1000热循环仪（Bio-Rad Laboratories，目录号：1851148EDU）
MP Fastprep-24匀浆器（MP Biomedicals，目录号：116004500）

程序

感染（图1）
注意：本节介绍使用鼻内途径的Balb/C小鼠感染RSV。
1. 稀释RSV原液[用于RSV原种的制备参见Sun和López （2016）]在无菌PBS中稀释至浓度为5×10 6 TCID 50 /35μl。将稀释的病毒置于冰上。
2. 麻醉小鼠与40微升/20 克重量的氯胺酮/甲苯噻嗪溶液。确保每个鼠标都是完全睡眠和对脚趾捏力刺激无反应
3. 保持鼠标垂直与头部倾斜回来，并缓慢地递送35微升使用100μl移液管将病毒稀释到其鼻孔中。解决方案应完全吸入肺部，不要吞咽通过嘴。
4. 将鼠标放回其笼子，并监视它，直到它从麻醉苏醒
  图1.小鼠鼻内免疫的程序。 A.使用P100 移液管以每只小鼠施用35μl病毒溶液。 B.手持a 完全麻醉的鼠标垂直和放置病毒溶液它的鼻孔一滴一滴。 C.将鼠标放回笼子里监视它，直到它醒了。
肺组织收集
注意：本节介绍从小鼠感染的组织的收集，以后检查病毒载量。
1. 准备收集管：对于每个样品，加入1 ml TRIzol到一个MP Fastprep管包含一个陶瓷球。其他类似均质可以使用技术
2. 安乐死小鼠在所需的时间点后感染（通常6小时，10小时，24小时，每天最多一个周）或使用CO 2或其它批准的方法。
3. 把一只死了的老鼠放在聚苯乙烯泡沫上，用针刺住每个肢体，肚子朝上
4. 用70％乙醇喷涂鼠标的毛皮。
5. 使用剪刀打开腹腔和胸腔。打开腹腔暴露隔膜的下侧。使用剪刀刺穿隔膜。切掉胸腔小鼠和充分暴露心脏和肺。收集左边的两个叶并放入含有TRIzol的Fastprep管中。总是带走相同肺叶保持一致性。可以使用其他叶为其他目的。
6. 在FastPrep-24匀浆器或类似设备上均化肺。均化20秒。重复三次。
7. 将匀浆样品等分至500μl等分试样。将其置于-80℃下储存。
总RNA提取
注意：本节介绍从感染组织中提取RNA，以后用于检测病毒基因组。
1. 解冻一个等分试样，加入500μl新鲜TRIzol，总体积为1 ml
2. 加入200微升氯仿，并剧烈摇动15秒。
3. 在室温下放置3分钟，以进行相分离。在微量离心机中在4℃下以12,800×g离心15分钟。
4. 小心地收集3/4的上层水相而不打扰或接触界面或有机层。合并水相与等体积的异丙醇。轻轻倒转混合。
5. -20℃放置10-20分钟以沉淀。
6. 在微量离心机中于4℃下以12,800×g离心15分钟。
7. 弃去上清液，小心不要丢失沉淀。
8. 用1ml的75％乙醇洗涤沉淀。短暂涡旋或用吸移管向上和向下多次样品。
9. 在微量离心机中于4℃下以12,800×g离心10分钟。
10. 除去上清液并倒置试管。让沉淀物风干至澄清。
11. 将沉淀重悬在30-40μl超纯无核酸酶dH 2 O中。
12. 在65℃孵育5分钟。
13. 在Nanodrop 1000或等价物中测量RNA浓度。
逆转录（RT）
注意：本节介绍C部分中制备的总RNA转化为cDNA。简言之，使用oil-dT将mRNA转化成总cDNA（T-cDNA）。然后将该cDNA用于扩增作为对照的持家基因。使用特异性结合基因组5'端的RSV基因组RT引物将RSV基因组转化为病毒基因组cDNA（V-cDNA）。 V-cDNA将用于扩增RSV病毒基因组。

D1。 RT的总mRNA（T-cDNA）
1. 使用2μgRNA进行逆转录
2. 准备RT 反应混合物在PCR管中在冰上使用高容量RNA-cDNA试剂盒作为（每个样品）：2x RT缓冲液5μl，20x RT酶混合物0.5μl，RNA 2 μg，无核酸酶的H 2 O 2量足以达到10μl。
  注意：oligo-dT引物包含在RT缓冲液中。
3. 轻轻混合并短暂离心以收集管底部的所有组分
4. 放入BioRad C1000 Thermal Cycler并运行程序合成cDNA如下：37℃60分钟，95℃5分钟，4℃保持
5. 将总cDNA（T-cDNA）储存于-20℃，直到准备进行qPCR分析
D2。病毒基因组（V-cDNA）RT
1. 使用2μgRNA进行逆转录
2. 混合以下每个样品的成分在一个管中：1μl的基因组RT引物（50 μM），1μl的dNTP（10mM），2μg的RNA，无核酸酶的H 2 O（总计为10 μl）。
3. 在65℃孵育10分钟。
4. 准备RT反应使用SuperScript III Supers III第一链在冰上使用PCR管混合合成系统如下（每个样品）：5x RT缓冲液2μl，25mM MgCl 24μl，0.1M DTT2μl，RNase OUT1μl，SS III1μl。
5. 孵育后，向每个样品中加入10μlRT混合物。混合良好。
6. 在50℃孵育50分钟。
7. 在85℃加热5分钟
8. 每个样品加入1μlRNase H（从SuperScript III逆转录酶试剂盒），并在37℃孵育20分钟。
9. 保持病毒基因组cDNA（V-cDNA）在-20°C，直到准备好qPCR分析
定量PCR（qPCR）
注意：本节描述了感染组织中存在的病毒基因组的定量。将从D部分产生的T-cDNA和V-cDNA分别用作管家基因和RSV基因组的模板。两个管家基因的拷贝数用于计算随后用于计算病毒基因组的相对拷贝数的持家性指数（hki）。图2中显示了感染后第1天的病毒基因组qPCR结果的实例。
1. qPCR反应使用特异性引物一式三份进行在Viia7 Applied Biosystem中的Power SYBR Green PCR Master Mixture Lightcycler或同等产品。
2. 解冻T-和V-cDNA，并在使用前旋转
3. 使用dH 2 O稀释cDNA 1:40
4. 加载板的4μl稀释的cDNA /孔一式三份。
5. 准备主混合物：SYBR绿色（5微升）与1微升的qPCR引物混合。加载板与主混合6μl/孔。对于管家基因，使用T-cDNA作为模板检查Rsp11 和α-微管蛋白作为参考。对于 RSV基因组，使用RSV g引物对，V-cDNA作为模板
6. 使用以下程序运行qPCR（表1）：
  
  表1. DI-PCR程序
7. 基于小鼠样品的Rsp11 和α-微管蛋白的水平对病毒基因组拷贝数进行归一化，使用公式：相对拷贝数字= 2,500 * 1.93 ^（Ct基因组-hki），hki = Ct Rsp11的中位数和 Ct α-微管蛋白。用于qPCR的引物序列可见于材料在qPCR引物下。结果见图2.
  
  图2. RSV 病毒基因组qPCR。用PBS（模拟）或RSV感染小鼠。肺在感染后第1天收获并使用RSV基因组RT-qPCR分析测定。每个点代表每只小鼠的RSV基因组定量。

食谱

氯胺酮/甲苯噻嗪溶液（2ml） 1 ml氯胺酮 0.14ml赛拉嗪
1 ml PBS
在BSL2罩中混合并在室温下贮存
底漆准备
将引物稀释到100μM作为储备溶液对于逆转录（RT引物），使用不含核酸酶的H 2 O以1:50的工作浓度稀释储备溶液1:2。
对于qPCR引物，使用反向和正向引物作为一对。准备750微升引物混合物作为工作库存，如下所述：
37.5μl正向引物的储液 37.5μl反向引物的储液
675μl不含核酸酶的H 2

致谢

这项工作是由国家卫生研究所（CBL）授权AI083284支持。本文所述的方案基于以下论文：Sun等人（2015）; Sun和López（2016）。

参考文献

Sun，Y.，andLópez，C. B.（2016）。准备具有高或低含量的缺陷性病毒颗粒的呼吸道合胞病毒，并从病毒性原种中纯化。生物协议 6（9）：e1820
Sun，Y.，Jain，D.，Koziol-White，C.J.，Genoyer，E.，Gilbert，M.，Tapia，K.，Panettieri，R.A.，Jr.，Hodinka，R.L.and Lopez，来自呼吸道合胞病毒的免疫刺激性缺陷型病毒基因组在小鼠和人类感染期间促进强烈的先天抗病毒反应。 PLoS Pathog 11（9）：e1005122。
Tapia，K.，Kim，W. K.，Sun，Y.，Mercado-Lopez，X.，Dunay，E.，Wise，M.，Adu，M.and Lopez，C.B。体内产生的有缺陷的病毒基因组提供关键的危险信号触发肺抗病毒免疫。 PLoS Pathog 9（10）：e1003703。