材料和试剂

上皮细胞系（例如Caco-2，IEC-6，CMT-93细胞系）
DMEM培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11965-092）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10082147）
胶原（I型，大鼠尾）（Corning，目录号：354236）
L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：C7352）
来自大肠杆菌0111：B4（Sigma-Aldrich，目录号：L4391）的脂多糖
盐水（Sigma-Aldrich，目录号：S8776）
注意：在Sigma-Aldrich网站上也将其命名为"氯化钠溶液（0.9％）"。
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：A6283）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15140122）
胶原蛋白溶液（见配方）
半胱氨酸溶液（参见配方）
细胞培养基（参见配方）

设备

ECISZθ（Theta）和16W阵列站（Applied BioPhysics， http://www.biophysics.com /products-ecisz0.php ）
8W10E +文化软件（图1）

图1. 8W10E +文化软件（Applied BioPhysics， http：//www.biophysics .com/cultureware.php＃link8 ）

软件

ECISZθ软件

程序

清洁并涂抹培养皿
注意：有两种方法可用于清洁8W10E +培养皿中的电极（半胱氨酸处理或电稳定）。

半胱氨酸治疗
1. 放置200微升10毫米无菌的半胱氨酸溶液在每个孔10分钟。要冲洗孔，放500μl无菌培养基，盐水或水和吸出液体。重复冲洗步骤两次。
2. 放置300微升， 35μg/ml胶原溶液，并在室温下孵育一小时。要冲洗孔，放500μl无菌培养基，盐水或水并且抽吸液体。重复冲洗步骤两次。
电稳定
1. 在每个孔中加入300μl，35μg/ml胶原溶液，并在室温下孵育温度下1小时。要冲洗孔，放500μl无菌介质，盐水或水，并抽吸液体。重复冲洗步骤两次。
2. 每孔加入200μl培养基。
3. 将培养皿放在ECIS Array站中，按照以下步骤运行电气稳定：
  1. 将培养皿放在培养箱内的ECIS Array站中（图2）。启动ECISZθ软件。
  2. 单击"设置"按钮，检查阵列是否正确连接到系统。
  3. 如果数组图在屏幕的左下角位置变为绿色，阵列已正确连接。红色表示不存在数组或不正确连接的数组。如果数组图表显示红色，稍微调整文化餐具的位置单击"检查"以确定培养皿的每个孔连接正确。
  4. 单击"稳定"按钮（图3）。电稳定只应用于无细胞电极。
4. 稳定后，取出介质。
  
  图2.孵化器内的ECIS阵列工作站中的文化工具
接种培养皿中的上皮细胞
1. 准备单细胞悬液，并添加400微升的细胞悬浮液每个井。在每个孔中接种的细胞的数目可以是 10 ⁴至10 ⁵，这将取决于电池的特性。为了肠上皮细胞，5×10 8个通常在每个孔中铺板
2. 在孔中铺平细胞后，等待20至30分钟，然后将阵列放入培养箱空间。
获取数据
1. 将包含单元格的文化工具放入ECIS Array工作站并运行设置程序（1）检查所有油井是否正确连接（2）如图3所示。
  
  图3. ECIS软件和设置过程
2. 选择"多频率"（4）并单击开始（5），如图所示图3.系统将开始记录11处的阻抗预定义频率。点击"R"（6）和电阻值将在实验期间随时间显示。通常使用高频以监测细胞是否形成汇合单层。虽然细胞扩散，电阻值在4,000Hz时增加如图4所示。当细胞达到汇合时，电阻曲线将达到平台，此时可以加入处理以测试屏障功能的变化
  
  图4.附件和 IEC-6细胞的扩散行为。 5 x 10 4 个IEC-6细胞接种在ECIS培养皿中。细胞形成汇合单层后60手在此时点曲线达到高原。
3. 由于仪器的灵敏度媒体组件，最好每天更换媒体整个实验持续时间。点击暂停并取出文化。取出旧培养基，轻轻加入新鲜培养基每天。当细胞达到汇合，撤回200微升培养基和轻轻加入200微升含2x刺激的培养基，使最终中心为1x。脂多糖（LPS）与终浓度的1μg/ml可用作阳性对照
4. 在所需的时间点，单击完成（7）停止实验并分析数据
5. 低频（500 Hz或250 Hz）通常用于监视屏障功能的细胞单层。选择所需的时间点时间0并选择"Normalize"（图5）。根据产品手动，对于紧张的上皮细胞，阻抗在低频下更多并提供对层的屏障的非常有效的测量功能。 500Hz下的归一化电阻曲线如图所示结果表明LPS破坏了IEC-6的屏障功能细胞
  
  图5.数据标准化
  
  图6.中断 LPS刺激后的屏障功能。盐水或1μg/ml LPS 添加到IEC-6单层。减小的电阻值表示破坏屏障功能。绿色虚线表示时间点当添加LPS时
6. 如果你需要计算平均值多个孔的电阻值。通常，每次处理都进行一式三份和每个处理组的平均电阻值可以使用统计分析进行比较。选择所需的孔（2）并选择"group"（8）（图3）。然后点击。平均电阻带有误差棒的曲线将自动显示。

笔记

在清洁和涂覆培养皿时，避免使用磷酸盐缓冲盐水（PBS），因为PBS已显示干扰一些蛋白质被金属电极吸收。强烈建议使用半胱氨酸以获得一致的结果。但是如果半胱氨酸与电极上的蛋白质涂层相互作用，则优选电稳定
对于IEC-6细胞，使用胶原溶液涂覆培养皿。根据不同细胞的特性，也可以使用其它蛋白质如明胶和纤连蛋白
阻抗记录对温度变化非常敏感。在从培养箱中取出培养皿之前，首先在37℃下预热培养基。
如果文化工具未正确连接，则不会收集数据。因此，每次将文化用品放入工作站时，单击"检查"以确认正确的连接

食谱

胶原蛋白溶液
35μg/ml胶原蛋白通过用无菌蒸馏水（1:1000稀释）稀释乙酸来制备17.5mM乙酸溶液。将胶原溶解在17.5mM乙酸溶液中
半胱氨酸溶液
10mM半胱氨酸无菌蒸馏水
细胞培养基
DMEM
10％FBS
1％青霉素/链霉素

致谢

该方案改编自之前发表的论文（Meng等人，2015）和Applied Biophysics，Inc。提供的Ztheta手册。该工作部分由NIH授予RO1 DA 12104 ，RO1 DA 022935，RO1 DA031202，K05DA033881，P50 DA 011806和1R01DA034582。

参考文献

Meng，J.，Banerjee，S.，Li，D.，Sindberg，G. M.，Wang，F.，Ma，J.and Roy，S。由肠道微生物调节诱导的革兰氏阳性脓毒症的阿片样物质恶化，被IL-17A中和。 Sci Rep 5：10918.
ECIS操作手册1.2.123版： http://www.biophysics.com/publications/ECIS_Operation_Manual_v1_2_123.pdf 。