材料和试剂

离心管
小鼠
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84100）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A6003）
乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E4378）
HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15630-080）
蛋白酶抑制剂（100x）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：78429）
Digitonin（Sigma-Aldrich，目录号：D141）
D-甘露醇（Sigma-Aldrich，目录号：M4125）
氯化镁六水合物（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M9272）
氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：221473）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S5881）
提取缓冲液（每只大脑约50ml）（见Recipes）

设备

Dounce匀浆器和杵（A和B）
剪刀
镊子

图1.用于切碎和匀浆组织的工具。Dounce均质器和杵（A和B），小剪刀和镊子。

程序

注意：

为了获得高产量的功能性线粒体，程序必须尽可能快地（优选在小于1.5小时内）和样品始终保持在冰上。
程序本文所述的术语"小鼠"是指小鼠，但可以通过适应大鼠使用卷。功能测定应在3-4小时内进行隔离。
添加了降钙素以破坏突触体的质膜并释放突触体线粒体。
动物协议必须符合当地道德标准。

准备
1. 饥饿动物过夜（黑暗周期中8-16小时）。
  注意：此步骤是可选的，但会导致更重复的结果。
2. 准备冰块容器并放置：
  1. Dounce匀浆器和杵（图1）
  2. 每个样品三个离心管（20-50 ml）
  3. 每个样品含有冷提取缓冲液的一个烧杯
3. 将离心机和转子冷却至4℃
4. 动物解剖区。
  1. 小剪刀（图1）
  2. 镊子（图1）
程序
1. 牺牲小鼠颈椎脱位，立即取出完整的大脑，并将其放在冰冷的烧杯中用提取缓冲区
2. 冲洗大脑通过添加和删除冷新鲜缓冲液，直到大多数血液被去除（5-6次洗涤）（图3）。
3. 使用小剪刀将大脑放入冰中的烧杯中（图4）。
4. 将切碎的脑转移到Dounce匀浆器中（图5），并加入约3ml冷提取缓冲液
5. 用均化器放置在冰容器中，轻轻研磨组织十次用A杵（松）和另一个十与B杵（更紧）。避免气泡的形成至关重要获得高质量的线粒体
6. 将匀浆转移到离心管（图5），并用新鲜冷至30-40ml 提取缓冲液。遵循差速离心步骤（图 2）。
7. 在700×g和4℃离心10分钟。将上清液倒入新的冰冷管，并丢弃含有核和完整的丸细胞（图6）。
8. 重复该操作，在4℃下以700×g离心10分钟，然后将上清液倒入新冰冷管。
9. 在4℃下以10,000×g离心15分钟。弃去上清液，并在冰冷的提取中重悬浮沉淀缓冲液中至最终浓度为0.02％（图7）。
10. 在4℃下以10,000×g离心15分钟，弃去上清液，并在最小可能的情况下重悬最终的沉淀体积（约0.1ml）提取缓冲液或具体实验缓冲区（图8）。
  注意：
  1. 分离后，蛋白质浓度通过标准方法测定。通常，约2-3 从一个脑获得毫克的线粒体蛋白。
  2. 可以确定分离的线粒体的质量呼吸控制比（RCR）使用氧电极和测量其在存在和不存在ADP的情况下的氧消耗速率。 RCR应当范围为4-6，丙酮酸加苹果酸和1.5-3与琥珀酸加鱼藤酮。
图2.通过差速离心的线粒体分离。整个方案必须在4°C下进行。避免过多的移液，通过反转转移上清液

图3.提取的大脑

图4.小脑

图5.均匀化大脑

图6.颗粒1（P1，原子核和完整细胞）

图7.丸粒2（P2，富含线粒体的部分）

图8.重悬线粒体

食谱

提取缓冲液（新鲜制备）
125 mM蔗糖 250mM甘露糖 10 mM HEPES
10mM EGTA
0.01％BSA 1x蛋白酶抑制剂
pH 7.2用KOH或NaOH洗涤
注意：所用盐的类型可能会干扰一些功能测定。 KOH被推荐用于钙处理实验，因为它防止钙从线粒体通过Na + /Ca sup> 2 + exchange。对于使用safranin O的膜电位实验，建议NaOH允许用KOH和缬氨霉素校准。

致谢

我们感谢Jorgina Satrustegui博士，我们以前的工作在其实验室进行，Araceli del Arco博士，持续的帮助，指导，支持和批评性评论。

参考文献

1. Rueda，CB，Traba，J.，Amigo，I.，Llorente-Folch，I.，Gonzalez-Sanchez，P.，Pardo，B.，Esteban，JA，del Arco，A.and Satrustegui，J。 2015）。线粒体ATP-Mg/Pi载体SCaMC-3/Slc25a23抵消线粒体中PARP-1依赖性下降 ATP由神经元中的兴奋性毒性引起。 J Neurosci 35（8）：3566-3581。 2.Tahara，E.B.，Navarete，F.D.and Kowaltowski，A.J。（2009）。线粒体活性氧产生的组织特异性，底物特异性和位点特异性特征。 Free Radic Biol Med 46（9）：1283-1297。