材料和试剂

离心管
小鼠
钾盐
钠盐
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84100）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A6003）
乙二胺四乙酸二钠二水合物（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：ED2SS）
乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E4378）
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：646563）
HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15630-080）
蛋白酶抑制剂（100x）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：78429）
D-甘露醇（Sigma-Aldrich，目录号：M4125）
氯化镁六水合物（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M9272）
氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：221473）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S5881）
提取缓冲液（参见配方）
注意：每个肝脏大约提取100ml提取缓冲液。

设备

Dounce匀浆器和杵（A和B）
小剪刀
镊子

图1.用于切碎和匀浆组织的工具。Dounce均质器和杵（A和B），小剪刀和镊子。

程序

注意：

为了获得高产量的功能性线粒体，程序必须尽可能快地（优选在小于1.5小时内）和样品始终保持在冰上。
程序本文所述的术语"小鼠"是指小鼠，但可以通过适应大鼠使用卷。功能测定应在3-4小时内进行隔离。
根据线粒体的使用，可以使用钾盐或钠盐制备缓冲液。
如果钾可以影响随后的线粒体实验，KCl可以被甘露醇替代。
动物协议必须符合当地道德标准。

准备
1. 饥饿动物过夜（黑暗周期中8-16小时）
  注意：饥饿是可选的，但会导致更重复的结果，特别是在肝脏。
2. 准备冰块容器并放置：
  1. Dounce匀浆器和杵
  2. 每个样品三个离心管（20-50 ml）
  3. 每个样品含有提取缓冲液的一个烧杯
3. 将离心机和转子冷却至4℃。在冰上冷却Dounce和杵（图1）
4. 动物解剖材料（图1）
  1. 小剪刀
  2. 镊子
程序
1. 牺牲小鼠颈椎脱位，立即取出肝脏，并将其放在冰冷的烧杯中用提取缓冲液
2. 通过添加和去除冷的新鲜提取缓冲液冲洗肝脏，直到大部分血液被去除（5-6次洗涤）。
3. 使用小剪刀将烧杯中的肝脏广泛地剁碎，直到均匀（图3）
4. 将切碎的肝脏转移到Dounce匀浆器中，加入约3ml冷提取缓冲液
5. 用均化器放置在冰容器中，轻轻研磨组织十次用A杵（松）和另一个十与B 杵（更紧）。避免气泡的形成至关重要获得高质量的线粒体（图4）
6. 转移匀浆至离心管中（图5），并完成至30-40ml用新鲜冷提取缓冲液。跟随差分离心步骤（图2）
7. 在700×g离心10分钟和4 C。将上清液倒入新的冰冷管中并弃去沉淀含有核和完整细胞（图6）。
8. 重复在4℃下以700×g离心10分钟再次操作离心随后将上清液倒入新的冰冷管中。
9. 在4℃下以10,000×g离心15分钟。弃去上清液在冰冷的提取缓冲液中重悬浮沉淀（图7）。
10. 在4℃下以10,000×g离心15分钟，弃去上清液并以最小可能体积（周围）重悬最终的沉淀 0.3 ml）的提取缓冲液或特定的实验缓冲液 8）。
  注意：
  1. 分离后，蛋白质浓度为通过标准方法测定。通常，约30-40mg 线粒体蛋白从一个肝脏获得。
  2. 质量的孤立线粒体可以确定他们的呼吸控制比率（RCR），并测量它们的氧在存在和不存在ADP的情况下的消耗率。 RCR应该范围4-6与丙酮酸加苹果酸和1.5-3与琥珀酸加鱼藤酮。
图2.通过差速离心进行的线粒体分离。整个方案必须在4℃下进行。避免过多的移液，通过倒置转移上清液

图3.摘出的肝脏

图4.碎肝

图5.均质肝脏

图6.颗粒1（P1，核和完整细胞）

图7.粒2（P2，富含线粒体的部分）

图8.重悬的线粒体

食谱

提取缓冲液（新鲜制备）
250mM蔗糖 250mM甘露糖 25 mM HEPES
10 mM KCl
0.25mM EDTA 10mM EGTA
1.5mM MgCl 2·h/v1 mM DTT
0.1％BSA
1x蛋白酶抑制剂
pH 7.4用KOH或NaOH洗涤注意：所用盐的类型可能会干扰一些功能测定。 KOH被推荐用于钙处理实验，因为其防止钙从线粒体通过Na +/Ca +/Ca 2+交换器流出。对于使用safranin O的膜电位实验，建议NaOH允许用KOH和缬氨霉素校准。

致谢

我们感谢Jorgina Satrustegui博士，我们以前的工作在其实验室进行，Araceli del Arco博士，持续的帮助，指导，支持和批评性评论。

参考文献

Amigo，I.，Traba，J.，Gonzalez-Barroso，M.M.，Rueda，C.B.，Fernandez，M.，Rial，E.，Sanchez，A.，Satrustegui，J.and Del Arco，胰高血糖素调节氧化磷酸化需要通过Ca ^{2+ 增加基质腺嘌呤核苷酸含量，/sup>激活线粒体ATP-Mg/Pi载体SCaMC-3。 J Biol Chem 288（11）：7791-7802。}
Frezza，C.，Cipolat，S.and Scorrano，L。（2007）。细胞器分离：来自小鼠肝脏，肌肉和培养的成纤维细胞的功能性线粒体。 Nat Protoc 2（2）：287-295