材料和试剂

合适体积的锥形瓶
50ml管（SARSTEDT AG& Co，目录号：62.547.004）
250ml离心瓶（TermoFisher SCIENTIFIC，目录号：3141-0250）
Aphanizomenon ovalisporum ，菌株ILC-164 [从以色列的Kinneret湖分离（Banker等人，1997）]
BG11生长培养基（Stanman等人，1971）
BG/-K动力感应培养基
注意：其中K 2 HPO 4亚组分被Na 2 HPO 4亚组分代替的BG11培养基，。
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
无水乙二胺四乙酸二钠盐（Na-EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
来自鸡蛋清的溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：L6876）
注意：它也称为"Mucopeptide N-乙酰胞壁酰水解酶"或"muramidase"。
Lugol溶液（Sigma-Aldrich，目录号：L6146）
SYTOX（Invitrogen，目录号：S7020）注意：目前，它是"SYTOX Green Nucleic Acid Stain-5mM Solution in DMSO"（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：S7020 ）。
考马斯亮蓝R-250染色溶液（BIO RAD目录号：1610436）
分子量标记[所有蓝色预染色的蛋白质标准（M.W.10-250kD）]（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610373）
Tris（Sigma-Aldrich，目录号：252859）注意：在Sigma-Aldrich网站上也称为"三（羟甲基）氨基甲烷"。
Tris缓冲液（见配方）
Tris-EDTA-Mg缓冲液（见配方）
Tris-Mg缓冲液（见配方）
TE缓冲区（参见配方）
0.5 M EDTA储备溶液（见配方）
1 MgCl 2 2储备溶质（参见配方）
1 M NaCl（见配方）

设备

分光光度计（如Uvikon XS SECOMAM）
Sorvall离心机RC 6 Plus和适当的转子用于离心管或瓶子
涡流
超声波发生器[例如 Sonifier 450（Branson Ultrasonics）]
轨道摇床（例如MaxQ TM sup/2000和3000台式轨道摇床，TermoFisher SCIENTIFIC，型号：SHKA2000）
孵化器（调节温度和光）
明场/荧光倒置显微镜（例如Zeiss Axioobserver Z1）
注意：对于藻胆蛋白（EX-510-550nm; BS-565nm; EM-496nm LP）使用以下滤光片组：对于叶绿素（EX-425-443nm; 582nm LP）和SYTOX（EX-445-495nm; BS-500nm; EM-505-555nm）。
Utermohl沉淀室（Aquatic Research Instruments， http://www.aquaticresearch.com/sedimentation_chamber.htm ）
恒温水浴

程序

种植和动力诱导
1. 为了获得足够的生物量用于动力诱导，培养在Erlenmeyer烧瓶中使用0.5-1.0升BG11培养基。孵育培养物在28℃下连续光照（PAR）强度 30μmol光子m -1 s -1 ^{。培养物可以0.5升/分钟通气水族馆空气泵。}
2. 接近指数增长的结束相（在7-10天后，OD <750>应该在1.0左右）没有达到考虑重新启动这一步与一个新的接种），删除培养至低温培养箱（20-24℃）。允许3-4天在连续光（PAR）下以30μmol光子的强度驯化 m <-200 s ^-1和通气。然后通过离心收获培养物
3. 在室温下以5,000xg离心培养物5-10分钟，丢弃上清液。如果可用，使用离心机与转子装配500ml管或将培养物分配到50ml Falcon管中并进行几轮离心。在......的最后离心收集生物质在一个50ml falcon管中并丢弃尽可能多的生长培养基
4. 在BG/-K中洗涤沉淀培养基3次，通过将沉淀物重悬在钾中通过轻轻涡旋，随后在5,000×g离心5分钟室内温度。最后将沉淀重悬在0.5升BG/-K中使用1升锥形瓶。孵育K剥夺的文化在控制温度在20和24℃之间在连续光（PAR），强度为70-80μmol光子m -1 -2 ^-1。
5. 样品3-5ml 从诱导文化跟随机器的进步分化过程。在第4,7,10,14,21和4天收集样品 28后诱导。可以观察到附着到细丝的年轻动子自5天或7天后，可以观察到更多的附着动力以及直径大于年轻人的自由曲柄附件akinetes（图1）。
  注意：Akinete微分是一个非同步过程。
动力学的分离[从Razquin等人修改]。（1996）]
1. 在室温下以5,000xg离心21（或28）天的动物诱导培养物5-10分钟，弃去上清液。
2. 重悬浮沉淀并在Tris-EDTA-Mg缓冲液中洗涤几次。最后将洗过的沉淀重悬在20-50ml Tris-Mg缓冲液中，加入溶菌酶至终浓度为1mg ml -1 -1。使用新鲜制备的溶菌酶原液
3. 在37℃下孵育悬浮液2小时，以允许营养细胞的破坏，然后低速（3,000×g ）离心3分钟。在孵化期间，取样悬浮液用于细胞破碎的显微观察。如果需要，将与溶菌酶的孵育时间再延长1小时
4. 重新悬浮富含骨髓的颗粒在TE缓冲液中，并洗几个次在相同的缓冲液中以除去细胞残余物和可溶性溶菌酶。
5. 最后将富含akinete的沉淀物重悬在Tris中缓冲液保持在冰上，并简单地超声波使用30％的满强度（20秒间隔）（Sonifier 450）。重复超声处理步骤3-5次，但在显微镜下监测动力学完整性。的这个超声处理步骤的目的是破坏完整的营养细胞保留在悬浮液中。确保超声不是太侵略性和动力生存这一步。
6. 在低速（3,000xg）下离心机动搅拌器悬浮液i 在无菌蒸馏水中洗几次，最后将沉淀重悬于少量无菌蒸馏水中。保持在15℃和黑暗条件下悬浮。 akinetes的悬浮液可以在这些条件下保存至少6个月。
7. 在此阶段，从动力学悬浮液中取样，用于显微镜观察和计数。
计算动力
1. 从动物的各个阶段的培养物中收集等分试样（1-3ml）分化或在动力分离过程中。收集样品之后剧烈振荡培养物以确保均匀悬浮的丝和动力学。
2. 保存在Lugol的样品溶液（向3ml样品中加入1滴-50μl）。 Lugol保存的样品可以在室温下避光保存直至计数。保存样品可以储存4-6个月。
3. 细丝，营养细胞并在Utermohl沉降室中使用a计算动力学倒置显微镜（Utermohl，1958）。两类akinetes可以定义;细丝附着的动力蛋白（图1D1和D14）和成熟的自由动力学（图1D 21和IA）。细丝附着的尺寸随着它们的分化进行，动量增加，它们超过a 生物量0.4ng（Sukenik等人，2013）。在它们的分化期间，动脉瘤的特征在于细胞壁增厚表观藻青素颗粒的积累（图1）。
  
  图1。来自动力学诱导的细丝和动量的光学显微照片 D ，A filament with vegetative （转移到BG/-K培养基）; 细丝7 诱导后天数。注意年轻akinetes的存在（箭头）; D 14，诱导后14天的细丝。一个发达的附件 akinetes标有箭头; D 21，短细丝附着动力学和自由动力学诱导21天后; IA，隔绝 akinetes。 D sub 7和D 14中的灰色箭头指示氰霉素颗粒。比例尺=10μm
孤立动力学的质量控制
1. 孤立动力蛋白上的残留溶菌酶
  虽然孤立强烈洗涤动力蛋白悬浮液以除去过量的溶菌酶，我们发现残余溶菌酶在动力学部分，推测是相关的与细胞壁。这些残基可能在后来干扰动力发芽。从分离的动力学中去除酶通过用含有100mM NaCl的TE缓冲液洗涤几次进行通过SDS-12％PAGE评估（图2）。
  注意：使用TE + 100mM NaCl的三次洗涤足以从溶菌酶处理的分离的动力学中除去残留的溶菌酶。
2. 动机生命力的评估
  为了评估重要骨骼的百分比使用SYTOX解决方案最终浓度为1μM。 SYTOX是高亲和力核酸仅可通过损伤的质膜进入细胞的染色，例如死细胞的那些。因此可以区分死和活的动力。作为重要动力的确认，它是建议使用SYTOX染色以及自动荧光藻类天线和叶绿素a在活的动力学（图 3）。
  
  图2.盐滴定对溶菌酶解离的影响从akinetes。蛋白在Laemmmli SDS-PAGE系统（12％丙烯酰胺）并用考马斯蓝染色。 M，分子量标记（所有蓝色预染色的蛋白质标准，M.W.10-250kD）; AK，粗品从孤立动力学提取的可溶性蛋白;泳道0至420为用TE Buffer +洗涤分离的动物后的可溶性蛋白 NaCl（分别为0-420mM NaCl）。溶菌酶通过该处理释放的肽（MW 14.4kD）由a表示箭头。注意，盐浓度越高，溶菌酶越高从孤立的动力学中解离
  
  图3.在分离之前和之后Akinete诱导的Aphanizomenon ovalisporum 样品 akinetes。上图，培养在诱导的第17天;下面板，孤立的akinetes。样品用SYTOX染色并使用观察荧光显微镜与滤波器的立方体设置为荧光叶绿素（EX-425-443nm; BS-452nm; EM-496nm LP），藻胆蛋白（EX-510-550nm; BS-565nm; EM-582nm LP）和SYTOX（EX-445-495nm; BS-500nm; EM-505-555nm）。注意四个死（SYTOX正）分离前的动力学（黄色箭头）和一个死的动力学隔离。比例尺=50μm

笔记

有关再现性和变异性的说明：
1. 动机诱导的最佳条件是钾缺乏，中等光强度（75μmol光子m -2 -2s -1 s -1）和温度20-24℃，如Sukenik等人所述。（2013）。
2. 每3-4天遵循分化过程，因为开发计划表中可能会发生一些变化。
其他说明和技巧提示：
1. 当您获得该方案的经验时，可以稍微调整溶菌酶的最终浓度和孵育时间
2. 在分离程序的步骤5B需要温和的超声处理。按照循环之间的超声处理的有效性显微镜观察。

食谱

Tris缓冲液
50 mM Tris
pH 7.5
Tris-EDTA-Mg缓冲液
含有10mM EDTA和1mM MgCl 2·h/v的50mM Tris（pH7.5）
Tris-Mg缓冲液
含有1mM MgCl 2·h/v的50mM Tris（pH7.5）
TE缓冲区
50mM Tris（pH7.5）和10mM EDTA
0.5 M EDTA储备液
Na-EDTA（186.12g/L）
1 MgCl 2 2储备溶质（95.21g/L）
1M NaCl（58.44g/L）

致谢

The protocol was modified from Razquin et al. (1996). The work was supported by research grants from the Israel Science Foundation (ISF grant No. 319/12), a Joint German-Israeli-Project (FKZ 02WT0985, WR803) from German Ministry of Research and Technology (BMBF) and Israel Ministry of Science and Technology (MOST). R. N. K-L was supported by Levy Eshkol Fellowship (no. 3-9476) Israel Ministry of Science and Technology (MOST).

References

Banker, R., Carmeli, S., Hadas, O., Teltsch, B., Porat, R. and Sukenik, A. (1997). Identification of cylindrospermopsin in Aphanizomenon ovalisporum (Cyanophyceae) isolated from Lake Kinneret, Israel. Journal of Phycology 33(4): 613-616.
Maldener, I., Summers, M. L. and Sukenik, A. (2014). Cellular differentiation in Filamentous Cyanobacteria. In: Flores, E. and Herrero, A. (eds). The cell biology of cyanobacteria. Caister Academic Press: 263-290.
Razquin, P., Fillat, M. F., Schmitz, S., Stricker, O., Bohme, H., Gomez-Moreno, C. and Peleato, M. L. (1996). Expression of ferredoxin-NADP+ reductase 在来自鱼腥藻的异囊中。生物化学316（Pt 1）：157-160。
Stanier，R.Y.，Kunisawa，R.，Mandel，M。和Cohen-Bazire，G。（1971）。单细胞蓝绿藻的纯化和性质（Chroococcales订单） Bacteriol Rev 35（2）：171-205。
Sukenik，A.，Kaplan-Levy，R.N.，Viner-Mozzini，Y.，Quesada，A.and Hadas，O.（2013）。钾缺乏会引发Aphanizomenon ovalisporum中的休眠细胞（akinetes）的发展。（Nostocales，Cyanoprokaryota）（1）。
49（3）：580-587。
Sukenik，A.，Maldener，I.，Delhaye，T.，Viner-Mozzini，Y.，Sela，D。和Bormans，M。藻蓝蛋白在蓝细菌中休眠细胞（akinetes）发育期间的碳同化和积累Aphanizomenon ovalisporum 。前微型生物 6：1067.
Sukenik，A.，Beardall，J。和Hadas，O。（2007）。光合作用的发育和成熟机能的表征（Cyanoprokaryota）。 43（4）：780-788。
Utermohl，H.（1958）。 Zur Vervollkommnung der quantitativen Phytoplankton -Methodik。 Inter Ver Theor Ange Limnol 9：1-38。