材料和试剂

无菌培养皿
滤纸（MACHEREY-NAGEL GmbH& Co.，目录号：434009或类似类型）
3M微孔纸带（VWR International，目录号：115-8172）
正方形（7 x 7厘米）或圆形（Ø5厘米; 35多孔插图）塑料盆和托盘
泥炭 - 浮石基质（SoMi 513 Dachstauden）（HAWITA GRUPPE GmbH）
ARACON锥管（Betatech bvba）
大（夹心式）棕色纸袋
小白皮书袋（Baumann Saatzuchtbedarf，目录号：3.065.002或类似风格）
15ml Falcon管（VWR International，目录号：734-0452）
2ml Eppendorf安全锁管（VWR International，目录号：211-2165）
2ml螺旋盖管（VWR International，目录号：211-0093）
具有插入物的色谱小瓶（VWR International，目录号：548-0120）
用于色谱小瓶（VWR International，目录号：548-1151）的快速盖子
手动移液器提示
拟南芥种子
Murashige和Skoog（MS）基础盐（Sigma-Aldrich，目录号：M5519-10L）
琼脂（Carl Roth GmbH + Co，目录号：4807.2）
D - （ - ） - 核糖（Rib）（Sigma-Aldrich，目录号：R7500-5G）
L - （+） - 阿拉伯糖（Ara）（Sigma-Aldrich，目录号：A3256-25G）
L - （ - ） - 岩藻糖（Fuc）（Sigma-Aldrich，目录号：F2252-5G）
D - （+） - 半乳糖（Gal）（Sigma-Aldrich，目录号：G0750-25G）
D - （+） - 半乳糖醛酸一水合物（GalA）（Sigma-Aldrich，目录号：48280-5G-F）
D - （+） - 葡萄糖（Glc）（Sigma-Aldrich，目录号：G8270-100G）
D-葡萄糖醛酸（GlcA）（Sigma-Aldrich，目录号：G5269-10G）
D - （+） - 甘露糖（Man）（Sigma-Aldrich，目录号：M8574-25G）
L-鼠李糖一水合物（Rha）（Sigma-Aldrich，目录号：R3875-5G）
D - （+） - 木糖（Xyl）（Sigma-Aldrich，目录号：X3877-25G）
超纯水（25℃时为18.2MΩ·cm）
氢氧化钠（NaOH）（VWR International，目录号：BAKR3727.2500）
三氟乙酸（TFA）（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：6957.1）
½MS板（参见配方）
糖标准储备（见配方）
9糖混合（见配方）
2 M TFA（参见配方）
10 mM NaOH（参见配方）
733mM NaOH（参见配方）

设备

层流净化台
生长室（Johnson Controls）
高压灭菌器
水净化系统（Milli-Q或类似风格）
手动移液器（Eppendorf AG，Research plus和Repeater Plus样式）
分析天平（Mettler-Toledo，型号：XSE205DU）
球磨机（Retsch GmbH，目录号：MM400）
两个用于球磨机的24个TissueLyser适配器（QIAGEN，目录号：69982）
安全眼镜
实验室外套
耐化学性手套（Honeywell，Dermatril，目录号：740或类似风格）
通风橱
样品浓缩器（Bibby Scientific Limited，Techne，目录号：FSC400D），装备有
1. 127mm针（Bibby Scientific Limited，Techne，目录号：F7210）
2. 驱动块加热器（Bibby Scientific Limited，Techne，目录号：DB200/3）
3. 三个铝块（Bibby Scientific Limited，Techne，目录号：F3505）
4. 连接到中央空气供应，在通风橱
制冰机
离子色谱（IC）：装有
的Dionex DX-600系统
1. AS50自动进样器
2. GP50梯度泵
3. ED50电化学检测器
4. CarboPac PA20保护柱（Thermo Fisher Scientific，Dionex Softron，目录号：060144）
5. CarboPac PA20分析柱（Thermo Fisher Scientific，Dionex Softron，目录号：60142）
涡流混合器（Scientific Industries Inc.，型号：Vortex-Genie 2或类似型）
台式离心机（与2 ml管相容）
带有用于2ml管的盖的架（VWR International，目录号：211-0215）
带有小瓶盖的盒子（neoLab，目录号：2-2580）
精尖镊子（VWR International;目录号：232-0107或类似类型）
血清移液管（Thermo Fisher Scientific，Nunc型或类似样式）
2升容量瓶
氦气罐

软件

Chromeleon 6.8色谱数据系统软件（Thermo Fisher Scientific，Dionex）
具有真实统计资源包的Microsoft Excel（ http://www.real-statistics.com/ ）

程序

植物生长，种子收获和存储
种子生产，收获和储存的方式可影响粘液的含量和组成（参见最近的综述，Voiniciuc等人，2015c）。为了便于不同基因型之间的比较，有必要在相同条件下总是生长植物。我们推荐以下程序，其产生高质量的种子和一致的粘液化学型（Voiniciuc等人，2015a; Voiniciuc等人，2015b; Voiniciuc等人。，2015c）。
1. 使用滤纸，将种子撒在½MS板上，并用密封板 3M微孔纸带。在连续光下发芽种子
2. 五至七天后（当子叶完全打开时），转移幼苗使用镊子到单个盆充满湿泥炭 - 砂 - 浮石基质。用塑料圆顶盖一周。
3. 在恒定光（〜170μEm -2 s -1 s -1）下，温度（20℃）下生长植物，和相对湿度（60％），每两至三天浇水一次需要
4. 开花前，用一个ARACON锥覆盖每个植物和管，以防止异花授粉和种子扩散。删除任何不能包含在ARACON管内的分支。
5. 什么时候大多数长角果变黄（在A1步骤后大约60天），切割植物从其基部并通过摇动每个植物收获成熟的种子进入大的棕色纸袋中10秒。
  注意：为了保持生物变异，每株植物使用一个袋子，不能混合种子。
6. 将每个棕色袋子的内容物倒入一块干净的过滤器上纸，并使用镊子小心地去除植物性材料。只转移种子到小白皮书袋。

全部粘液提取

为每个实验准备一份电子表格以及相关信息（例如样品＃;种子重量;种子袋;基因型）。最多48个未知可以立即处理样品。简化标签和以后处理，应为样品分配一个字母（例如实验A）和a 两位数字，确保单个数字前面加上零（例如 A01到A48）。
预先标记2毫升安全锁的侧面具有样品编号的管。使用分析天平添加4-6毫克种子，并在电子表格中记录精确重量。

通过将表1所列的体积加入2ml螺旋盖管中制备9-Sugar混合物标准品的稀释系列。

表1. 9- 糖混合（10 mg/ml）稀释系列用于单糖定量

标签	S000	S 001	S002	S005	S 01 0	S025	S050	S075	S100	S125
微博	0	1	2	5	10	25	50	75	100	125
μg	0	1	2	5	10	25	50	75	100	125

准备足够的30微克/毫升Rib（内标）加入1毫升到所有样品和糖标准品。对于典型的实验用48个样品和10个标准品，加入180μl的10mg/ml Rib和用超纯水填充至60ml
使用中继移液器，向所有样品和标准品中加入1ml内标
通过摇动含种子进行总胶浆提取在球磨机中使用两个24Tissue Lyser在30Hz下进行15分钟适配器，在室温（〜24°C）。
旋转块180°和在30Hz下再摇动15分钟以完成全部粘液萃取。这从所有的粘液从野生型种子（图1）。

图1.在粘液提取后种子的钌红染色。如先前在24孔板中将野生型（Col-0）种子染色（Voiniciuc等人，2015b），在水（A）中轻轻摇动后，或全部粘液提取（B）。条= 2mm。
让种子沉降至少30秒。对于每个样品，转移800微升将上清液倒入2ml螺旋帽管中，在其侧面预先标记。
注意：请勿转移任何种子，并且不要在这一点上盖住管。
干样品和标准品在45°C空气流下使用样品集中器。从这一点向前处理所有管相同。

基质多糖水解
1. 使用中继器移液管，加入300μl的2M TFA到所有管。
  注意：在通风橱中使用适当的个人防护装备进行TFA。
2. 紧紧盖上每个管，并涡旋3秒。
3. 将管转移到Techne Dri块（预热至120℃）并孵育60分钟
4. 凉快的加热块和管在冰。以最高速度离心管30秒。
5. 盖帽管，并在45℃的空气流下使用样品浓缩器蒸发TFA。
  注意：请以正确的顺序将盖子放在干净的纸巾上。
样品的最终洗脱
1. 加入600微升的高压灭菌，超纯水的所有管使用中继移液器。涡旋混合3秒。
  注意：如果使用中等摇晃强度和小心，管不需要为此步骤加盖，因为溶液会不会溢出。
2. 转移150μl从每个管到带有插入物的预标记的IC小瓶。用盖子密封小瓶。
3. 将管置于Dionex DX-600系统的自动进样器中升序，但随机化（例如使用Microsoft Excel）注射顺序的样品和标准品。

单糖的分离和定量

通过高效阴离子交换分离和定量单糖使用脉冲电流检测（HPAEC-PAD）进行层析 CarboPac PA20保护和分析柱，在40°C和恒定流量速率为0.4ml/min
确保三个足够的体积 IC洗脱液（超纯水，10mM NaOH和733mM NaOH;图2）可用于运行实验批次中的所有样品和标准

图2.样品注入后抽取的洗脱液的比例
用2mM NaOH（80％水，20％10mM NaOH）平衡柱10分钟
注入10μl每个样品。
在18分钟的过程中用2mM NaOH分离中性糖（图2）。
然后，泵513mM NaOH 7.5分钟以分离糖醛酸（图2）
最后，用733mM NaOH冲洗柱4分钟（图2）。
注意：对每个样品和标准品重复步骤E3-7中的方法（图2）。

通过配置自动注释单糖峰峰值表（表2）和检测参数（表3） Chromeleon色谱数据系统软件。这些参数工作适用于大多数标准品和样品（图3），仅需要如果保留时间在之间稍微移动，则进行微小调整实验。
注意：根据您的个人设置和列年龄，您可能需要调整流速或NaOH浓度在中性糖洗脱期间。不要降低NaOH浓度因为这对灵敏度有影响。

表2. Chromeleon 6.8峰表，用于识别和校准单糖

峰名	Ret。时间（分钟）	窗口	标准	Int。类型	校准。类型	峰值类型
Fuc	4.50	0.270 AN	内肋	区域	Quad	B-M-B
Rha	8.00	0.400 AN	内肋	区域	Quad	B-M
Ara	8.70	0.400 AN	内肋	区域	Quad	M-B
Gal	11.00	0.800 AF	内肋	区域	Quad	B-M-B
Glc	12.25	0.800 AN	内肋	区域	Quad	B-M-B
Xyl	14.40	1.000 AF	内肋	区域	Quad	B-M
男士	15.00	1.000公司	内肋	区域	Quad	M-B
肋	18.70	1.300 AN	ISTD内部	区域	林	B-M-B
GalA	26.26	0.800公司	内肋	区域	林	B-M-B
GlcA	28.40	0.800公司	内肋	区域	林	B-M-B

表3. Chromeleon 6.8 De 部分注释单糖峰的参数

时间	参数。 na m e	参数。值	频道
0.00	禁止集成	在	所有频道
3.60	禁止集成	关闭	所有频道
4.10	最低面积	0.5	所有频道
4.75	最小区域	1	所有频道
5.00	禁止集成	在	所有频道
6.60	禁止集成	关闭	所有频道
6.60	锁定基准	在	所有频道
7.25	最小区域	0.5	所有频道
9.80	锁定基准	关闭	所有频道
9.80	禁止集成	在	所有频道
10.20	禁止集成	关闭	所有频道
10.40	锁定基准	在	所有频道
12.70	禁止集成	在	所有频道
12.80	锁定基准	关闭	所有频道
13.10	禁止集成	关闭	所有频道
14.00	最小区域	0.25	所有频道
14.00	锁定基准	在	所有频道
16.00	锁定基准	关闭	所有频道
18.00	最小区域	10	所有频道
20.50	禁止集成	在	所有频道
25.50	禁止集成	关闭	所有频道
25.60	最小区域	0.5	所有频道
27.00	禁止集成	在	所有频道
28.20	禁止集成	关闭	所有频道
28.20	最小区域	0.5	所有频道
29.00	禁止集成	在	所有频道

检查Chromeleon中的色谱图以确保所有峰都是正确标记。手动注释Ara和Man的峰必需，与更丰富的糖重叠。
通过定义在Chromeleon中的标准和浓度（表1和2），自动生成所有单糖的校准曲线，归一化为Rib（内标）。
注意：如有必要，请检查校准图并禁用重要的异常值。
样品中所有单糖的量（以μg表示）基于校准曲线自动计算并且可以从Chromeleon导出进一步计算。
注意：Fuc是在拟南芥的总粘液提取物中以痕量检测种子（图3; Voiniciuc等，2015c），而GlcA通常不是在这些样本中检测到。

图3.导出的示例色谱图从Chromeleon软件。垂直轴表示检测到信号（nC）。横轴表示注射后时间（min）。

最终计算和统计分析
进一步的计算在Microsoft Excel中执行。总粘液提取物的单糖组成可以表示为绝对（图4A）或相对量（图4B）。

图4.来自Col-0野生型的总粘液提取物的组成。数据显示三个生物重复的平均值。（A）中的误差条表示标准偏差。
1. 糖的量（以μg表示）可以除以种子的量（以mg表示）用于每次粘液提取，计算绝对组成（μg糖/mg种子）。
  注意：每mg种子的粘液总量是样品中所有糖值的总和。
2. 绝对单糖水平也可以表示为数字的分子归一化到所用种子的量。计算 nmol糖/mg种子，将步骤F1中获得的值除以相应糖的分子量（表4），并乘以结果1000。
  
  表4.最终计算的单糖的摩尔质量
  
  S uga r
  Fuc
  Rha
  Ara
  Gal
  Glc
  Xyl
  男士
  GalA
  GlcA
  
  质量
  164.16
  164.16
  150.13
  180.16
  180.16
  150.13
  180.16
  194.14
  194.14
3. 粘液中的相对单糖组成可以表示为a 摩尔百分比（mol％），并且等于所分割的每种单体的量除以所有糖的总和（均来自步骤F2）
4. 统计分析以比较野生型和突变体的粘液组成可以在Excel中执行。特定的重大变化单糖（以绝对或相对量表示）之间的两个基因型与多个生物复制可以使用内置的T.TEST功能识别。当许多突变体（和其各种糖组分）与野生型，有条件的格式化（例如使用 P - 值<0.05）突出显示单元格可用于快速揭示哪些组件被显着改变。双因素方差分析（ANOVA）也可以在Excel中进行实际统计资源包（ http://www.real-statistics.com/）评估如何两种独立的粘液组成突变（通过野生型，单和双突变体的分析样品）。

食谱

½MS板
对于500ml溶液（产生约25个板），混合1.08g MS基础盐，3.5g琼脂和水。
高压灭菌，并在干净的工作台上将培养基（仍然温热）倒入无菌培养皿中。当保存在无菌袋中时，板可以在4℃下储存至少6个月。
糖标准品（10 mg/ml）
对于除GalA和Rha之外的每种单糖，通过将100mg糖溶解在10ml无菌15ml Falcon管中的经高压灭菌的超纯水中来制备单独的原液。
由于它们以一水合物形式出售，使用109mg GalA和111mg Rha而不是标准100mg。
等分Rib股票2毫升安全锁管，因为它经常使用。
将所有原液储存在-20°C。
9-糖混合物（1mg/ml）
对于10ml溶液，将1ml水与1ml Fuc，Rha，Ara，Gal，Glc，Xyl，Man，GalA和GlcA（全部10mg/ml储液）混合。
将9-Sugar混合物分装到2ml Safe Lock试管中，并储存在-20℃
2 M三氟乙酸（TFA）通过向423ml超纯水中缓慢加入77ml TFA（12.98M）制备500ml 2M TFA溶液。
注意：在通风橱中使用适当的个人防护装备进行TFA。
10mM NaOH（IC洗脱液）
使用容量瓶将2 L超纯水转移到适当的洗脱液容器
使用1ml血清移液管加入1040μl50％（w/v）NaOH 使用氦气脱气洗脱液5分钟
733mM NaOH（IC洗脱液）
使用容量瓶将2 L超纯水转移到适当的洗脱液容器
使用50ml血清移液管加入总共80ml的50％（w/v）NaOH 使用氦气脱气洗脱液5分钟

致谢

本文描述的方法源自（Voiniciuc等人，2015c），并且由（Voiniciuc等人，2015a; Voiniciuc等人，/em>，2015b）。我们感谢BjörnUsadel对协议有帮助的意见。这项工作由加拿大自然科学和工程研究理事会（PGS-D3授予C.V.）支持。作者贡献：C.V.和M.G开发了该方法。 C. V.写了协议。

参考文献

Haughn，G. W.和Western，T.L。（2012）。拟南芥种衣液是一种特殊的细胞壁，可用作植物细胞壁结构和功能的遗传分析模型。前植物科学 3：64.
North，H.M.，Berger，A.，Saez-Aguayo，S.and Ralet，M.C。（2014）。使用种皮突变体了解多糖生产和特性：开发天然变体的未来前景。 a> Ann Bot 114（6）：1251-1263。
Voiniciuc，C.，Gunl，M.，Schmidt，M. H.和Usadel，B。（2015a）。由IRREGULAR XYLEM14和MUCILAGE-RELATED21制造的高支化木聚糖将粘液连接至拟南芥 >种子。植物生理学 169（4）：2481-2495。
Voiniciuc，C.，Schmidt，M. H.，Berger，A.，Yang，B.，Ebert，B.，Scheller，H. V.，North，H. M.，Usadel，B.and Gunl， MUCILAGE-RELATED10可产生在拟南芥种子中保持果胶和纤维素结构的半乳葡甘露聚糖粘液。植物生理学169（1）：403-420。
Voiniciuc，C.，Yang，B.，Schmidt，M. H.，Gunl，M。和Usadel，B.（2015c）。开始凝胶：如何拟南芥种皮表皮细胞产生特化的继发细胞。Int J Mol Sci 16（2）：3452-3473。