材料和试剂

塑料灭菌注射器：3ml（BD，目录号：309657）和10ml（BD，目录号：309604）
针：22号（BD，Eclipse ^TM，目录号：305768）和27号（BD，Eclipse ^TM，目录号：305758）
锥形管：Falcon 50ml（Corning，目录号：352070）
试管
1.5ml Microfuge管（Thermo Fisher Scientific，目录号：05-408-130）
单倍体 Ustilago maydis 已知交配型的试验菌株
玉米幼苗测定种子：品种金色矮脚鸡（Rich Farm Garden Supply）
玉米穗接种种子：品种汤姆拇指（种子交换）
无菌蒸馏水（sdH 2 O）
CuSO 4溶液（1％）（Sigma-Aldrich，目录号：451657）
酪氨酸（Becton，Dickinson and Company，目录号：223050）
硝酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A9642）
酵母提取物（Sigma-Aldrich，目录号：Y1625）
活性炭（Sigma-Aldrich，目录号：C9157）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
硫酸钠（Na 2 SO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：239313）
氯化钙脱水物（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：223506）
硼酸（H 3 BO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：B6768）
氯化锰（II）（MnCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：244589）
氯化锌（ZnCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：746355）
无水钼酸钠（Na 2 MoO 4·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：331058）
氯化铁（III）（FeCl 3）（Sigma-Aldrich，目录号：157740）
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）2％琼脂（Sigma-Aldrich）（参见Recipes）
马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）（Sigma-Aldrich）（参见Recipes）
木炭配对板培养基（见配方）
U。 maydis盐溶液（Sigma-Aldrich）（参见Recipes）
微量元素溶液（Sigma-Aldrich）（参见配方）

设备

玻璃搅拌棒
移液器
陶瓷砂浆和杵
无菌奶酪布
血细胞计数器或自动细胞计数器
光学显微镜
用JS7.5转子（Beckman Coulter）装有50ml锥形管（Beckman Coulter，型号：J25I）的离心机
生长室（Conviron，型号：E15）
层流罩
旋转培养箱（VWR International，New Brunswick，型号：12500KC）
固定培养箱（Precision ^TM，型号：815）

程序

U。可能在任何地上，活跃生长的组织中潜在地产生冬孢子。然而，为了研究目的，将描述两个工厂阶段，每个具有其特别的优点。这些常用的阶段是：

幼苗（7日龄）。
优点：幼苗方便快速和节省空间。
成熟的耳朵。
优点：穗具有产生大量冬孢子的优点，尽管植物必须更大，从接种到孢子生产期的时间与幼苗的时间相似。
在授粉前应进行耳朵接种;去除流苏可以提高胆汁产量（Snetselaar等人，2001）。

植物接种U。 maydis 冬孢子生产
1. Streak U。 maydis 相容的交配菌株接种到新鲜马铃薯葡萄糖上琼脂（PDA）平板（来自较老的PDA平板或甘油储液）和在30℃孵育直至单个菌落出现（图1）。选择一个单菌落的兼容交配菌株分成单独的试管含有5ml马铃薯葡萄糖肉汤（PDB），并在37℃下生长过夜旋转振荡器设定在250rpm和30℃。仔细标记每个管相应的交配型菌株在每个管中生长。 PDA maydis 板可以用石蜡膜密封并在4℃下颠倒储存 2-3周。在将来使用前将其重新划线到新鲜的PDA平板上。
2. 使1/100稀释的过夜培养物和估计细胞浓度使用血细胞计数器或自动细胞计数器。 U。 maydis 细胞是雪茄形的，并且测量宽度在2和4μm之间和20和30μm的长度。
3. 如下制备50ml的细胞悬浮液。稀释和组合菌株，使用sdH 2 O，终浓度为10 6个细胞/ml。这个混合物将用于接种植物，重要的是兼容 maydis 菌株在大致相同的比例细胞混合物以达到最佳冬孢子产量。细胞混合物对于接种至少几个小时是稳定的。
4. 玉米植株的接种
  1. 玉米幼苗接种（7日龄）。一个有效的注射部位每幼苗应该足够了。然而，经常需要移动 ?如果注射流被抑制则针。接种每个幼苗 ?使用3ml一次性塑料无菌注射器装配细胞混合物 ?用27号针。将针头插入直径一半左右。 2.5 mm）插入假茎（通过生长形成的内腔）叶）在土壤线上约1厘米（图2）。注入足够的混合物 ?直到液体可以观察到上升到区域的顶部叶开始扩增（1-2ml细胞悬浮液之间）。
  2. 玉米穗接种。成长'汤姆拇指'玉米植物在温室约40天或直到耳朵开始发育。之前接种，用剪刀剪丝到耳壳顶部并检查年轻 ?耳朵（通过感觉耳朵的外部检查谷物是否存在），以确保还没有发生谷物灌装。使用a 10ml皮下注射器用22号针注射细胞悬浮液在耳朵的多个位置，直到液体观察到溢出（3-10ml）从丝切割的点。注入液体 ?耳朵通常比幼苗需要更多的力;移动针 ?找到合适的点有效注射。
5. 对于所有接种的组织，允许疱发展和冬孢子形成。这个步骤将需要大约3-4周的任一组织（图3）。
6. 收获完全发育的黑色色素痣（着色是从冬孢子）。
7. 可以立即提取立毛孔，或者可以是疱疹 ?在室温下在纸袋中干燥以备后续提取
Teliospore隔离
1. 研磨和消毒胆组织[4-5小或1大新鲜或干燥胆汁]在含有30ml 1％CuSO 4的研钵中。注意发布的 ?黑色冬孢子。电穿孔细胞壁极其 ?坚韧，因此在研磨过程中不会被损坏。
2. 通过几层无菌过滤浸软组织干酪包布放入无菌的50ml锥形管中。孵育流过 ?30分钟，以允许CuSO 4的抗菌作用。
3. 将离心机中的颗粒冬孢子放置在4,000×g下5分钟。
4. 将沉淀重悬在50ml sdH 2 O中。
5. 再次重复步骤B3至B4。
6. 在1ml sdH 2 O中重悬悬浮的冬孢子丸。
7. 将大约50-150μl的孢子悬浮液扩散到两个PDA平板上用50μg/ml链霉素和氨苄青霉素修饰（PDA-Strep-Amp）。
8. 在30℃下孵育过夜。
9. 当在立体声下可见小菌落时（<0.5mm直径）显微镜，向板中加入1ml sdH 2 O 2。滑动灭菌弯头玻璃棒穿过板悬浮微菌落细胞。吸移孢子囊（细胞）悬浮液加入无菌微量离心管中。
10. 板稀释（10-1,10-2,10-3稀释效果良好）到新鲜的PDA-Strep-Amp平板上。
11. 挑选后代菌落到新鲜的平板上，并分析感兴趣的性状的分离
配对测试
在从冬孢子分离菌株期间使用板交配测定以建立子代菌株的交配型（Andrews等人，2000）。 U。 maydis 具有由两个独立分类位点控制的四极配合系统：a和b（B?lker等人，2012）。交配和进一步的丝状发育需要菌株在两种交配型基因座上不同。该测定也用于测试突变株交配的能力。
1. 挑选从冬孢子分离的遗传纯的子代殖民地（如上所述）到5ml PDB中并如上所述生长过夜。
2. 成长测试员maydis 菌株（例如 a1b1; a2b1; a1b2; a2b2）。
3. 点样菌株在炭板上。
  1. 首先检测测试仪菌株。对于每个测试点3-5μl到炭上形成柱（图4a）。
  2. 让接种液滴干燥（在层流罩中）。
  3. 在每个测试菌株的顶部，点样3-5μl待测试的每个后代菌株（如图4a所示）。
4. 在黑暗中室温孵育平板1-2天。正面的交配事件由于发展的白色模糊增长证明 ?的短细丝指示后的二核的形成（图4b）。
  偶尔，突变体被隔离失去他们完成部分或全部配对过程的潜力木炭板。在这些情况下，对抗（Snetselaar等人，1996; ?Gold等人，1997）和细胞凋亡测定（Trueheart和Herskowitz， 1992; Mayorga和Gold，1999）可以用于测试这些的能力菌株经历交配反应的第一阶段

代表数据

图1. maydis 单倍体菌落。典型的乳白色菌落。 maydis 生长在PDA培养基上。尺寸栏为2 mm。

图2.用相容的U的混合物接种玉米幼苗。单倍体细胞。将直径一半的注射器针头插入玉米幼苗假茎中距离土壤线约1厘米处。注入足够的细胞混合物填充幼苗假茎腔;观察从叶轮顶部的液体表达。

图3.在用相容的U接种的玉米幼苗和穗中的gall生产和冬孢子发育。 maydis 菌株。 a。在幼苗茎部（箭头）的下部，靠近土壤形成大的疱。 b。在幼茎和叶片的末梢部分形成一系列小疱（箭头）。 C。幼穗横切，显示冬孢子的生产;注意对应于成熟冬孢子（箭头）的小黑色区域。 d。成熟耳s由于丰富的黑化冬孢子，蒴果发育的后期阶段的冬孢子产量增加（箭头）和gall s变得更暗。

图4.平板交配测定。 a）。建议的配对板组织的表示。每个分离的菌株与已知交配型的测试菌株共点，以确定子代的交配型。 b）。交配板产生了之前确定的交配类型的后代。测试四个自噬缺失突变株（Nadal和Gold，2010）（MN8.1; MN8.4; MN8.11和MN8.12）的交配能力。白色模糊生长指示阳性交配事件。 ?表示对应行的模拟（水）接种，显示未配对菌株的形态。

笔记

木炭配对板应在相对冷却时浇注，并在与工作台直接接触的单层中良好混合。这是必要的，因为在长时间凝固时，木炭将从悬浮液中脱落并降低配合反应的效率
对于没有目录编号的项目，我们使用多个供应商并取得同样的成功
不要在常规喷洒杀真菌剂的地方进行接种实验。

食谱

注意：化学试剂获自Sigma-Aldrich。

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）2％琼脂
39g马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）粉末
5克补充琼脂
1 L H sub 2 O
在121℃，15psi下高压灭菌15分钟
马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）
24g马铃薯葡萄糖肉汤粉末
1 L H sub 2 O
在121℃，15psi下高压灭菌15分钟
木炭对板培养基
10克酪蛋白氨基酸
3克硝酸铵
20克酵母提取物（5％或5克酵母提取物工作更好）
125毫升Ustilago maydis 盐溶液（见下文） H 2 O至1L（pH 7.0） 15克琼脂
5克活性炭，搅拌
在121℃，15psi下高压灭菌15分钟
高压灭菌后，加入：
10ml过滤灭菌的50％葡萄糖
黑粉菌盐溶液
16g KH sub 2 PO 4 sub
4g Na 2 SO 4 SO 4/
8克KCl
2g MgSO 4。7H 2 O 2 1克CaCl 2 ^。 2H <2> O
8ml微量元素溶液
H sub 2 O到1L
在4°C下存储
微量元素溶液
30mg H sub 3 BO Sub 3
70mg MnCl 2
200mg ZnCl 2/
20mg Na 2 MO 4 sub 。 2H O
50mg FeCl 3
200mg CuSO 4
H sub 2 O至500ml
储存于4°C

致谢

我们感谢我们的资金来源，包括美国农业和国家科学基金会竞争性资助计划。这里描述的用于冬孢子收获和发芽和子代分离的方法改变自标准方案（Holliday，1974）。

参考文献

Alexopoulos，C.J。和Mims，C.W.E。等人（1996）。第21章担子菌门。订单Ustilaginales。 Smut真菌。 In：Alexopoulos，C.J.，Mims，C.W.and Blackwell，M。（eds）。介绍性真菌学。 Wiley，639-657
Andrews，D.L.，Egan，J.D.，Mayorga，M.E.and Gold，S.E。（2000）。 Ustilago maydis ubc4和ubc5基因编码MAP激酶级联的成员需要用于丝状生长。 Mol Plant Microbe Interact 13（7）：781-786。
B?lker，M.，Genin，S.，Lehmler，C。和Kahmann，R。（1995）。 Ustilago maydis的交配和二态性的遗传调控 Can J Bot 73（S1），320-325。
Holliday，R。（1974）。 Ustilago maydis。章节：细菌，噬菌体和真菌，载于：King，R.C。（ed。） Springer，575-595。
Nadal，M.和Gold，S.E。（2010）。自噬基因ATG8和ATG1会影响黑粉菌的形态发生和致病性。 Mol Plant Pathol 11（4）：463-478。
Snetselaar，K.M.，Carfioli，M.A。和Cordisco，K.M。（2001）。授粉可以保护玉米卵巢免受 Ustilago maydis ，玉米黑麦真菌。 Can J Bot 79（12）：1390-1399。