材料和试剂

1ml比色杯（SARSTEDT AG& Co.，目录号：67.742）
15ml管（Falcon Tube）（DKSH，目录号：LP021015）
50ml管（Falcon管）（DKSH，目录号：LP21050）
96孔微量滴定盘（组织培养板）（DKSH，目录号：LP031096）
铝箔
细菌细胞培养
Mueller Hinton（MH）肉汤（按照制造商的说明制备）（Oxoid Australia，目录号：CM0405）
MH琼脂培养基（25ml /培养皿）（根据制造商的说明书制备）（Oxoid Australia，目录号：CM0337）
循环AMP XP ^TM测定试剂盒（Cell Signaling Technology，目录号：4339）
蛋白质测定DC< sup>试剂A& B（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-121）
蛋白质测定牛血清白蛋白（BSA）标准品（0,0.125,0.25,0.5,1,2.5,5mg/ml蛋白质）
Milli Q水
氯化钠（NaCl）（Chem Supply，目录号：SA046-5kg）
氯化钾（KCl）（Thermo Fisher Scientific，Ajax Finechem，目录号：A383-500g）
磷酸钠（Na 2 HPO 4）（Merck Millipore Corporation，目录编号：7558-79-4）
磷酸钾（KH 2 PO 4）（Merck Millipore Corporation，目录号：7778-77-0）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）

设备

VIS分光光度计，能够读取OD 600nm [例如640（Beckman Coulter）]。
ELISA平板阅读器能够在450nm读取吸光度[例如Multiskan EX原件（Adelab Scientific）]
法国压力传感器能够在30,000 psi或者细胞破碎器下操作[例如来自TS系列台式破碎机（恒定系统）的单射头]
冰桶
无菌接种环
摇匀培养箱（37℃，200rpm）
离心机（能够容纳50ml管，以8,000×g旋转并保持4℃的预冷却温度）[例如 Benchtop Centrifuge Hermle Z383K（DKSH）] < br />
水平轨道摇床（?30rpm）[例如OM5（Ratek，Adelab Scientific）]

软件

用于ELISA读板仪的软件，可以导出原始OD600 nm值（例如Microsoft Excel）
Graphpad prism（Graphpad Software Inc）

程序

在琼脂平板上生长所需菌株的过夜培养物（约16小时），包括任何抗生素选择（如果需要）。准备用于培养的MH肉汤培养基和无菌PBS
第二天：在无菌条件下，使用无菌接种环从琼脂平板除去单个菌落，并接种在50ml管中的5ml MH肉汤，包括任何抗生素选择（如果需要）。在37℃下以200rpm生长培养物过夜（?16h）
次日：将过夜培养物的1：100稀释液置于50ml管中的15ml MH肉汤中。在37℃下以200rpm振荡培养培养物直至培养物达到OD 600 = 0.7（约3-4小时），使用分光光度计测量。
当细菌培养物生长时，将离心机预冷至4℃，制备冰桶，在冰上预冷PBS。
从培养箱中取出细菌细胞并置于冰上，以8,000×g离心样品20分钟，4℃，倾析上清液并将细胞沉淀保存在冰上;样品可以在-20℃下冷冻最多6个月
将沉淀重悬于3ml冷却的PBS缓冲液中，并将样品保存在冰上
用一次性头设置细胞破碎器（预冷却至4℃）;设置为30,000psi，并且处理样品，在冰上将溶解的细胞收集到新的15ml管中。
在4℃下以8,000×g离心样品20分钟，除去上清液并在-80℃下储存，直到需要时，最多6个月。
取出10μl样品，使用蛋白质测定DC ^TM试剂盒按照生产商的说明书定量样品中的总蛋白。
使用微量滴定盘，在A行的7个孔中加入20μl试剂A;这是用于BSA标准样品。在B行的3个孔中加入20μl的试剂A;这将用于您的样品。
向20μlA行中的试剂A中，向7个单独的孔中加入5μl的每种BSA蛋白标准品（0,0.125,0.25,0.5,1,2.5,5mg/ml）。向20μlB行中的试剂A中，向每个孔中加入5μl样品
随后向所有使用的孔中加入200μl试剂B，使样品在室温下反应3分钟
使用Multiskan在600nm测量孔的吸光度;使用BSA蛋白质标准品在Excel电子表格中创建标准曲线。然后使用线的方程计算样品中的蛋白质的量。参见注释3的实验细节，以及作为代表性实例的表1和图1
使用计算的来自步骤13的样品的蛋白质浓度，将PBS中的最终蛋白质浓度调节至1mg/ml以用于cAMP分析。
将所有Cyclic AMP XPTM测定试剂盒溶液和cAMP XPTM兔mAb涂布的微孔条在室温下。
将Milli-Q中的20x洗涤缓冲液稀释为1x缓冲液
从Milli-Q水中提供的10x储备液中制备1x细胞裂解缓冲液，然后加入1mM苯甲基磺酰氟。
在1x细胞裂解缓冲液中制备新鲜的cAMP标准品：在450μl的1x细胞裂解缓冲液中加入50μlcAMP标准品（2.4 M）以制备240 nM cAMP。
使用240nM cAMP溶液在细胞裂解缓冲液中进行1:3连续稀释，产生以下浓度：80nM，26.7nM，8.9nM，3.0nM，1nM，0.3nM和0nM。
对于未知样品，将50μl粗蛋白提取物（1mg/ml）一式三份加入微孔板中。随后，向所有标准品和样品中加入50μl提供的辣根过氧化物酶连接的cAMP溶液。用铝箔覆盖并在室温下在水平轨道板振荡器（?30rpm）上孵育3小时。
提取微孔条中的溶液，并用200μl/孔的1x洗涤缓冲液洗涤4次;每次丢弃所有液体，但不允许井干
加入100μl提供的试剂盒中的3,3'，5,5'-四甲基联苯胺底物溶液，并在室温下温育平板30分钟。继续监测孔，因为它们将在反应开始时具有透明的颜色，这将变成黄色。监测孔的颜色变化，当看到强烈的黄色时，应停止反应;这可能需要在试剂盒中描述的30分钟孵育时间框架之前进行
加入100μl终止液，然后立即测量450 nm处的吸光度，参见代表性数据3（表2和图2）。
使用来自标准曲线的标准的倒数，并对从蛋白质测定中添加的总蛋白的量进行调整;计算cAMP的量，以nM/1mg粗蛋白提取物计

代表数据

表明细菌鲍氏不动杆菌中cAMP定量的代表性实验可以在Giles等人（2015）对鲍氏不动杆菌中的薄膜形成所必需的基因的研究
以下是excel BSA标准曲线的实例。

表1. BSA蛋白标准品及其在OD 600的相对吸光度

使用蛋白测定试剂盒测定吸光度并使用Multiskan EX读数。随后绘制数据，如图1所示。

图1. BSA蛋白标准曲线。对于范围为0-5mg/ml的BSA蛋白标准品，测定OD 600nm（nm）处的吸光度。使用蛋白质测定DCTM试剂盒测定蛋白质浓度。使用y = mx + c（Excel 2003，Microsoft TM）绘制最佳拟合线。
在1x细胞裂解缓冲液中稀释的cAMP标准品的代表在Cyclic AMP XP TM supec TM测定试剂盒制造商的说明书的第1页;下面还提供了一个示例（表2和图2）。

表2.cAMP标准品及其在OD 450nm（nm）的相对吸光度

^{a 使用Cyclic AMP XP TM测定试剂盒测定cAMP的量（nM），并使用Multiskan EX读取吸光度。随后绘制数据，如图2所示。

图2.cAMP浓度标准曲线。对于范围从0.3-80nM的cAMP标准品测定OD 450nm（nm）处的吸光度。 cAMP浓度使用Cyclic AMP XPTM Assay试剂盒测定。使用y = mln（x）+ c（Excel 2003，Microsoft ^TM）绘制最佳拟合线。使用该标准曲线，可以测定细胞裂解物的cAMP的量}

笔记

该方案被优化用于测量鲍曼不动杆菌中的细胞内cAMP水平。对于其他细菌，使用适当的生长培养基，抗生素和生长条件
读取OD 600的方法：在无菌条件下，将1ml培养物吸入1ml比色杯中，并在分光光度计中测量OD 600长度的细胞密度;每1小时重复一次或直到培养物达到所需的OD <600> <0.7>
在OD 600下使用Multiskan的蛋白质测定：在室温下等待3分钟后，测量微量滴定板中的样品，然后将数据输出到excel电子表格以进行数据操作并保存。扩展表1应包含您的Multiskan原始数据。然后在电泳片2柱A中，1号BSA型标准品，B柱型号OD 600;在A列中，行2-8键入BSA标准品编号，在B列中显示BSA标准品的Multiskan读数（见表1）。然后突出显示所有数据，制作没有标记的散点图，添加趋势线，添加线的方程以及标题和轴标签（参见图1）。你的样本是一式三份，平均你的样本，然后插入你的平均数到线的方程作为Y相交，找到X：例如Y = 0.066 X + 0.0732：如果Y是0.2，则0.2 - 0.0732 = 0.1268/0.066 = 1.92 mg/ml蛋白质在您的样品中
当在加入终止溶液之前等待颜色从透明变为黄色时，必须在整个反应过程中连续监测微孔板。在约15分钟后，取决于样品中cAMP的浓度，将发生强烈的黄色。一旦整个井是黄色的，添加停止溶液。
环状AMP当冷冻时（在-20℃下约6个月）可长期稳定，其可在4℃下储存2周。
使用恒定系统单击头导致鲍曼不动杆菌细胞的可靠破坏。使用其他机械化学方法或使用不同物种的细胞破碎的效率需要根据经验确定。

食谱

磷酸盐缓冲液（PBS）
对于500毫升
4.0克NaCl
0.1克KCl
0.7克Na 2 HPO 4
0.1克KH 2 PO 4 sub/
O高达500毫升
pH为7.4的pH样品最终

致谢

该方案根据制造商的说明书专门针对真核细胞使用Cyclic AMP XP TM supay TM测定试剂盒进行修改和改编。该项目得到国家卫生和医学研究委员会澳大利亚项目拨款535053和弗林德斯医学研究基金会赠款的资助。 SKG是弗林德斯大学研究奖学金（FURS）的接受者。

参考文献

Giles，S.K.，Stroeher，U.H.，Eijkelkamp，B.A。和Brown，M.H。（2015）。鉴定鲍氏不动杆菌中的薄膜形成所必需的基因。 BMC Microbiol 15：116.
McDonough，K.A。和Rodriguez，A。（2012）。环AMP在微生物病原体中的无数作用：从信号到剑。 Nat Rev Microbiol 10（1）：27-38。
Wolfgang，M.C.，Lee，V.T.，Gilmore，M.E.and Lory，S。（2003）。通过新型腺苷酸环化酶依赖性信号通路协调细菌毒力基因的调节。 em> Dev Cell 4（2）：253-263。