材料和试剂

100mm细胞培养皿（Sarstedt AG& Co，目录号：83.3902）
一次性血清移液器（橙色）
过滤微量吸头（Biotix，NEPTUNE）
1.6ml微量离心管（Biotix，NEPTUNE，目录号：3745X）
细胞刮刀（25cm）（Sarstedt AG& Co，目录号：83.1830）
塑料包装（CLEANWRAP）
BAS膜（Fujifilm Corporation）
剃刀（Dorco，型号：Pace Single Edge Blades DN52）
Costar Spin-X离心柱（Sigma-Aldrich，目录号：CLS8162-96EA）
人包皮成纤维细胞（HFF）细胞（ATCC，目录号：SCRC-104 TM）
Dulbecco's改良的Eagle培养基（DMEM）（具有高葡萄糖，具有4mM L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠）（GE Healthcare，HyClone TM，目录号：SH30022.FS）
胎牛血清（FBS）（增强美国GE Healthcare HyClone特征的细胞生长）（GE Healthcare，HyClone TM，目录号：SH30071.03HI）
GlutaMAX-I（100×）（100ml）（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：35050-061）
青霉素/链霉素溶液（P/S）（100x，10,000U/ml）（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：15-140-122）
冰
人巨细胞病毒（HCMV）的Towne株（ATCC，型号：VR-977 TM; NCBI登录号：FJ616285.1）
羊抗鼠IgG（Thermo Fisher Scientific，InvitrogenTM，目录号：11031）
Dynabeads Pan Mouse IgG（Thermo Fisher Scientific，InvitrogenTM，目录号：11041）
Pan抗AGO mAb 2A8（Diagenode，目录号：C15200167-100）
蛋白酶抑制剂混合物（Cell Signaling Technology，目录号：5871）
重组DNA酶I（Takara Bio Company，目录号：2270B）
RNA酶A（1MG，20单位/μl; 5mg/ml）（Thermo Fisher Scientific，Affymetrics，目录号：70194Y）
碱性磷酸酶，小牛肠（CIP）（New England Biolabs，目录号：M0290S）
（RA3）（5'-rApp-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-3'-ddC，5'-腺苷酸化，3'-二脱氧-C）（Integrated DNA Technologies，RNase Free HPLC Purification）
T4 RNA连接酶2，截短的K227Q（New England Biolabs，目录号：M0351L）
在RNA酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，Ambion TM，目录号：AM2696）中
ATP，[γ-32 P]，6,000Ci/mmol（222TBq/mmol）（PerkinElmer，目录号：NEG502Z500UC）
T4多核苷酸激酶（PNK）（Takara Bio Company，目录号：2021A）
10mM腺苷5'-三磷酸（ATP）（New England Biolabs，目录号：P0756S）
NuPAGE LDS样品缓冲液（4x）（Thermo Fisher Scientific，Novex TM，目录号：NP0007）
NuPAGE样品还原剂（10x）（Thermo Fisher Scientific，Novex TM，目录号：NP0004）
NuPAGE抗氧化剂（Thermo Fisher Scientific，Novex TM，目录号：NP0005）
NuPAGE TM Novex TM 4-12％Bis-Tris蛋白凝胶，1.0mm，10孔（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：NP0321BOX）
NuPAGE MOPS SDS运行缓冲液（20x）（Thermo Fisher Scientific，Novex TM，目录号：NP0001）
NuPAGE传输缓冲液（20x）（Thermo Fisher Scientific，Novex TM，目录号：NP0006）
Amersham Protran支持0.45NC（GE Healthcare Life Sciences，目录号：10600016）
牛血清白蛋白（BSA）（生命科学级粉末）（Merck Millipore Corporation，Probumin ，目录号：821006）
抗AGO mAb 21D2（韩国首尔国立大学生物科学学院Narry V. Kim实验室制造）
过氧化物酶AffiniPure山羊抗小鼠IgG（H + L）（Jackson ImmunoResearch Inc.，目录号：115-035-003）
EMD Millipore Immobilon TM Western化学发光HRP底物（ECL）（Thermo Fisher Scientific，目录号：WBKLS0050）
酸 - 苯酚：氯仿，pH 4.5（使用IAA，125:24:1）（RNA苯酚/氯仿）（Thermo Fisher Scientific，Ambion TM，目录号：AM9720）
线性丙烯酰胺（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9520）
3 M乙酸钠（pH 5.5）（Thermo Fisher Scientific，Ambion TM，目录号：AM9740）
乙醇（Merck Millipore Corporation，目录号：100983）
异丙醇（2-丙醇）（Merck Millipore Corporation，目录号：109634）
UltraPure TM DNase/RNase-Free蒸馏水（D.W.）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10977-015）
2x RNA上样缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Ambion TM，目录号：AM8546G）
mirVana TM探针& Marker Kit（Thermo Fisher Scientific，Ambion TM，目录号：AM1554）
10％Novex TBE-尿素凝胶，10孔（Thermo Fisher Scientific，InvitrogenTM，目录号：EC6875BOX）
T4 RNA连接酶（Takara Bio公司，目录号：2050B）
蛋白酶K（PK）（Thermo Fisher Scientific，Macherey-Nagel，目录号：740506）
5'-连接寡核苷酸（5'-Solexa衔接子）
5'-rGrUrUrCrArGrArGrUrUrCrUrArCrArGrUrCrCrGrArCrGrArUrC-3'（Integrated DNA Technologies，RNase Free HPLC Purification）
RNA RT引物（RTP）
5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'（Integrated DNA Technologies，RNase Free HPLC Purification）
5'-引物（Integrated DNA Technologies，RNase Free HPLC Purification）
1. RNA PCR引物（RP1）
  5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3'
3'-引物（Integrated DNA Technologies，RNase Free HPLC Purification）
1. RNA PCR引物，Index 1（RPI1）
  5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'
2. RNA PCR引物，Index 2（RPI2）
  5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'
3. RNA PCR引物，Index 3（RPI3）
  5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'
4. RNA PCR Primer，Index 4（RPI4）
  5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'
Phusion 高保真DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：F-530L）
dNTP混合物（Enzynomics，目录号：N001L）
SuperScript TM III逆转录酶（RT）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：18080-044）
（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：EC6265BOX）的6％，10％孔
低分子量DNA梯（新英格兰Biolabs，目录号：N3233L）
溴化乙锭（EtBr）（Sigma-Aldrich，目录号：E7637）
Dynabeads mRNA DIRECT TM试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Ambion TM，目录号：61011）
NEBNext Magnesium RNA Fragmentation Module（New England Biolabs，目录号：E6150S）
氯化钠（NaCl）（BioXtra，≥99.5％）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
氯化钾（KCl）（BioXtra，≥99.0％）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（BioXtra，≥99％）（Sigma-Aldrich，目录号：S7907）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（≥99.0％）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
（高质量Tris碱）（BioXtra，≥99.9％）（Sigma-Aldrich，目录号：T6791）。
NP-40 Alternative（Merck Millipore Corporation，目录号：492018）
十二烷基硫酸钠（SDS）[BioXtra，≥99.0％（GC）]（Sigma-Aldrich，目录号：L6026）
脱氧胆酸钠（BioXtra，无水，≥98％）（Sigma-Aldrich，目录号：30970）
乙二胺四乙酸（EDTA）（BioUltra，无水，≥98％）（Sigma-Aldrich，目录号：EDS）
氯化镁（MgCl 2）（无水，≥98％）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P7949）
NEBuffer3（New England Biolabs，目录号：B7003S）
10×T4 RNA连接酶缓冲液（New England Biolabs，目录号：B0216L）
50％PEG8000（与10×T4 RNA连接酶缓冲液一起提供）
10mM腺苷5'-三磷酸（ATP）（用10×T4 RNA连接酶缓冲液提供）
溴酚蓝（ACS试剂）（Sigma-Aldrich，目录号：114391）
二甲苯Cyanol FF（BioReagent）（Sigma-Aldrich，目录号：X4126）
甘油（BioXtra，无水，≥99％）（Sigma-Aldrich，目录号：G6279）
硼酸（BioReagen，≥99.5％）（Sigma-Aldrich，目录号：B6768）
Trizol试剂（Thermo Fisher Scientific，Ambion TM，目录号：15596018）
Dynabeads mRNA DIRECT TM纯化试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Ambion TM，目录号：61011）
NEBNext Magnesium RNA Fragmentation Module（New England Biolabs，目录号：E6150S）
南极磷酸酶（New England Biolabs，目录号：M0289S）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见配方）
裂解缓冲液（见配方）
高盐缓冲液（见配方）
洗涤缓冲液（见配方）
CIP混合（参见配方）
3'-连接混合物（参见配方）
热PNK混合（参见配方）
0.1％PBS-T（参见配方）
PK缓冲区（参见配方）
PK混合（参见配方）
PK /尿素缓冲液（参见配方）
5'-连接混合物（参见配方）
PCR混合（参见配方）（参见配方）
6x DNA加载缓冲液（参见配方）
TBE（Tris-硼酸盐-EDTA）（参见配方）

设备

CO 2培养箱（LabX，Sanyo，型号：CO 2）培养箱MCO-18AIC）
微量移液器（Gilson，PIPETMAN Classic TM P10，P20，P200和P1000，订购参考：F144802，F123600，F123601和F123602）
Rocker（FINEPCR，型号：CR300）
UV交联剂（Spectronics Corporation，型号：XL1500）
Vortexer（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2和目录号：SI-0256）
DynaMag TM -2磁体（Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）
旋转器（FINEPCR，型号：AG）和辅助滚筒（FINEPCR，型号：RD25-42）
干燥块加热和冷却振荡器（Sigma-Aldrich，目录号：T3317）的微波加热器
冷冻桌面微量离心机（Hanil BioMed Inc.，型号：Centrifuge Micro 17TR??）
XCell SureLock小室（Thermo Fisher Scientific，Novex TM，目录号：EI0001）
Chemidoc（Vilber Lourmat，型号：Fusion Spectra）
BAS 2500（Fujifilm Corporation）
深冷冻（-80℃冰箱）
PCR循环仪（MyCycler TM Thermal Cycler System）（Bio-Rad Laboratories，目录号：＃1709703）
Illumina HiSeq2000

软件

CutAdap软件
人类基因组（hg19）BLAST +（v.2.2.27）软件（Camacho et al。，2009）

程序

图1.整个程序（A）和AGO-CLIP-seq（B）的方案

注意：在整个AGO-CLIP-seq方案（图1）中，所有工作都必须在无RNA酶的环境中进行，并且只能使用无菌和无DNA酶/RNase的溶液和材料。

AGO-CLIP-seq
1. 细胞培养和HCMV感染
  注意：为了传播HCMV并准备HCMV股票，我们遵循前面的指令（Britt，2010）。
  1. HFF细胞获自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection） ?在补充有完全DMEM的5个100-mm培养皿中培养用10％FBS，2mM GlutaMAX-1和1×P/S在37℃在5％ ?CO ₂。
  2. 用PBS洗两次。
  3. 添加含HCMV的无血清 DMEM，MOI为3，总体积为2ml /皿，并在37℃下孵育 °C下1小时摇动，轻轻地，但以15的间隔彻底 min。
  4. 倾析病毒培养基，用PBS洗涤两次，加入10 ml 10％FBS，P/S，L-Glu DMEM /培养皿。
  5. 孵育指定的时间（24,48和72小时）。
2. 紫外线照射
  1. 用3ml /盘的冷PBS洗一次。
  2. 在5个皿中的4个中加入2ml /盘的冷PBS并总提取来自五个培养皿之一的RNA构建用于mRNA-seq的文库 smallRNA-seq（转到步骤B1a）。
  3. 在Spectrolinker中在250mJ/cm 2下使用254nm UV在冰上照射。
  4. 彻底清除PBS。
  5. 将制备的细胞储存在-80℃直至随后的步骤。
3. 抗体结合Dynabeads的制备
  1. 转移50微升羊α-小鼠免疫球蛋白G（IgG）共轭 Dynabead每个样品到1.5ml管中。收集磁性Dynabeads 使用DynaMeg-2磁体机架。 Panα-小鼠IgG缀合的Dynabead 可用作羊α-小鼠免疫球蛋白G（IgG）的替代物共轭Dynabead。
  2. 用0.1M NaHPO 4（pH8.1）洗涤两次并将珠再悬浮于200μl0.1M NaHPO 4（pH8.1）中。
  3. 每个样品加入30μgmAb 2A8作为泛抗AGO抗体。
  4. 在室温下旋转试管2小时（至少1小时）。
  5. 用裂解缓冲液洗涤两次
  6. 离开冰直到下一步。
4. 细胞裂解和部分RNA消化
  1. 加入1ml裂解缓冲液（用蛋白酶抑制剂混合物）样品盘，废细胞裂解物，将裂解物转移到下一个并重复，直到最后一道菜
  2. 最后，将裂解物转移到1.5ml管中
  3. 加入10μl重组DNA酶I，并在37°C和1,400 rpm下孵育 ?Eppendorf ^? Thermomixer ^? R培养10分钟，使裂解液粘度降低。
  4. 加入10μl稀释（1：1,000）核糖核酸酶。
  5. 在37℃和1,400rpm孵育10分钟。
  6. 立即将管转移到冰上。
  7. 在4℃和28,000×g离心30分钟
  8. 小心收集上清液并转移上清液，除了80μl，将用于免疫印迹，到一个新的管以在下一步骤中与制备的珠结合。
5. 免疫沉淀
  1. 将制备的Ab缀合的珠与细胞裂解物组合
  2. 在4℃下旋转3小时。
  3. 滗析上清液，用1ml高盐缓冲液洗涤珠两次
  4. 用1ml洗涤缓冲液洗涤两次。
6. 脱磷酸化
  1. 准备CIP混合。
  2. 向洗涤的珠子中加入100μlCIP混合物
  3. 在37℃和1400rpm下在Eppendorf Thermomixer R中孵育10分钟。
  4. 立即将管转移到冰上。
  5. 用1ml高盐缓冲液洗涤珠子两次，用1ml洗涤缓冲液洗涤两次。
7. 3'-衔接子连接
  1. 制备3'-连接混合物
  2. 向洗涤的珠子中加入100μl3'-连接混合物
  3. 在Eppendorf Thermomixer ^？ R中在16℃和1,400rpm温育过夜。
  4. 用1ml高盐缓冲液洗涤珠子两次，用1ml洗涤缓冲液洗涤两次。
8. RNA 5'-末端标记
  1. 准备热PNK混合物。
  2. 向洗涤的珠子中加入80μl热PNK混合物
  3. 在37℃和1,400rpm孵育15分钟
  4. 立即加入5μl10mM ATP。
  5. 在37℃和1,400rpm下在Eppendorf Thermomixer R中孵育5分钟。
  6. 用1ml高盐缓冲液洗涤珠子两次，用1ml洗涤缓冲液洗涤两次。
9. NuPAGE和膜转移
  1. AGO-RNA复合物通过在75℃温育从珠子洗脱 °C和1,400 rpm在30μl1.5x NuPAGE LDS样品缓冲液中10分钟。
  2. 将13μl裂解物与13μlNuPAGE LDS样品缓冲液混合 ?（4x）和2μlNuPAGE样品还原剂（10x），并在 75℃，10分钟
  3. 将样品装载在4-12％NuPAGE Bis-Tris凝胶上 ?根据制造商的说明使用800ml的1x MOPS 运行缓冲液与NuPAGE ^?抗氧化剂。
  4. 在150 V下运行凝胶2小时30分钟。
  5. 放射自显影凝胶约5?30分钟。
  6. 在打印的图中标记尺寸带。
  7. 将蛋白质-RNA复合物从凝胶转移到硝酸纤维素膜在130V使用根据的NuPAGE转移缓冲液70分钟制造商的说明。
  8. 转移后，用D.W冲洗膜，然后用塑料包装包裹
  9. 放射自显影凝胶约5?30分钟。
  10. 在打印的图中标记尺寸带（图2）。
10. Western印迹
  1. 取出转移的膜部分进行Western印迹将其置于50-100ml含有5％（w/v）BSA的0.1％（v/v）PBS-T中。
  2. 孵育膜1小时，在室温下轻轻摇动
  3. 用0.1％PBS-T短暂清洗膜两次
  4. 将每个膜放入一个小船和倾倒一抗溶液（20ml含有5％BSA的0.1％PBS-T和20μl抗AGO mAb 21D2）到船上
  5. 孵育至少4小时，在4°C轻轻摇动
  6. 用0.1％PBS-T短暂清洗膜两次
  7. 将膜放入一个小船，并倒入第二抗体溶液（20ml含有5％BSA的0.1％PBS-T和4μlHRP缀合的）山羊抗小鼠IgG）到船上
  8. 孵育膜1小时，在室温下轻轻摇动
  9. 用0.1％PBS-T至少洗涤膜5次，每次10分钟，轻轻摇动
  10. 使用Chemidoc进行ECL检测（图2B）
    
    图2.放射自显影和Western印迹的示意图 ?的剪切的AGO-RNA复合物和裂解物转移到硝酸纤维素膜从NuPAGE凝胶。 A.形象表示。地区应由剃刀切除，蛋白酶K处理由红色虚线矩形。评估AGO-CLIP-seq的IP效率程序和凝胶中确切的非共轭AGO蛋白位置，免疫印迹应在同一凝胶中进行放射自显影。 B.具有各种RNase条件的代表性数据 ?A和UV处理和使用的抗体。正如所看到的，更高使用核糖核酸酶A的浓度，放射自显影强度越低 ?观察到AGO-RNA复合物。 UV-未处理和使用IgG对照 IP不产生完整复合物的信号。 AGO，Argonaute蛋白; Ab HC，抗体重链; Ab LC，抗体轻链。
11. RNA分离和大小分离
  1. 准备PK混合物。
  2. 用剃刀切成110?160 kDa的条带，放入1.5 ml的试管中。（图2）
  3. 加入200μlPK混合物到含膜管中，并在50°C和1,400 rpm孵育1小时
  4. 加入200μlPK /尿素缓冲液并在Eppendorf Thermomixer ^R R中在50℃和1,400rpm温育1小时。
  5. 加入400μlRNA苯酚/氯仿，并在Eppendorf Thermomixer R中在30℃和1,400rpm温育5分钟。
  6. 在室温下以20,000×g离心5分钟
  7. 小心地将上层（水相）转移到新的1.5ml管中
  8. 加入1μl线性丙烯酰胺和40μl3 M醋酸钠pH 5.5，涡旋
  9. 加入1ml乙醇（EtOH）/异丙醇（1:1），彻底涡旋并在-20℃或-80℃下孵育过夜。
  10. 在4℃和28,000×g离心30分钟
  11. 用冷的75％EtOH洗涤沉淀一次，然后用100％EtOH洗涤一次
  12. 在室温下将沉淀物风干约10分钟
  13. 用5μl无核酸酶的D.W.重悬沉淀。并加入5μl2x RNA上样缓冲液
  14. 使用mirVana TM Probe& Gibco公司制备放射性标记的十年RNA标记物。标记工具包。
  15. 准备预制6％TBE-7M尿素凝胶
  16. 将样品管在95°C孵育5分钟
  17. 将样品和标记物装入制备的凝胶中并在200V下运行直到溴酚蓝（较低）染料迁移了75％的凝胶长度
  18. 放射自显影凝胶。
  19. 切割凝胶范围为40?77 nt，转移到一个新的1.5 ml管中，将凝胶粉碎成小块（图3A）。
  20. 加入400μl0.3M醋酸钠pH5.5，在4℃下旋转过夜
  21. 使用Costar Spin-X离心柱在4℃，20,000xg下过滤洗脱上清液15分钟。
  22. 将400μl洗脱液转移到新试管中。
  23. 加入1μl线性丙烯酰胺和1ml EtOH /异丙醇（1：1），涡旋，并在-80℃下孵育1小时以上。
  24. 在4℃和28,000×g离心30分钟
  25. 用冷的75％EtOH洗涤沉淀一次，然后用100％EtOH洗涤一次
  26. 在室温下将沉淀物风干约10分钟
    
    图3.放射自显影的示意图 3'-衔接子标记的剪接的RNA（A）和5'-衔接子/3'-衔接子标记 AGO-CLIPed RNA（B）。 A.凝胶切除步骤，从RNA提取凝胶，5'-衔接子连接，以及连接产物的苯酚提取显示; B.凝胶运行，凝胶切除，RNA提取的程序从凝胶中，显示了逆转录和PCR步骤。（A，B）应该由剃刀切除的区域由红点表示长方形。
12. 5'-衔接子连接和连接隔开
  1. 将沉淀重悬在6.5μl无核酸酶的D.W中，并将重悬的RNA转移到新管中。
  2. 准备5'-连接混合物
  3. 在95℃孵育2分钟，立即置于冰上（变性）
  4. 加入1μlT4 RNA连接酶和0.5μlSUPERase?在RNase抑制剂中总共20μl
  5. 在16℃下孵育过夜。
  6. 加入1μl线性丙烯酰胺，20μl3M乙酸钠（pH5.5），165μl无核酸酶D.W.和800μlEtOH：异丙醇（1:1）。
  7. 彻底涡旋并在-80℃下孵育至少1小时
  8. 在4℃和28,000×g离心30分钟
  9. 用冷的75％EtOH洗涤沉淀一次，然后用100％EtOH洗涤一次
  10. 在室温下将沉淀物风干约10分钟
  11. 用5μl无核酸酶的D.W.重悬沉淀，加入5μl2×RNA上样缓冲液
  12. 准备预制6％TBE-7M尿素凝胶，并在95°C孵育样品管5分钟。
  13. 将样品和十年标记物装入制备的预制凝胶中并在200V下运行，直到溴酚蓝（低级）染料迁移75％ ?的凝胶长度
  14. 放射自显影凝胶。
  15. 切割凝胶范围65?102 nt，转移到一个新的1.5毫升管，将凝胶粉碎成小块（图3B）。
  16. 加入400μl0.3M乙酸钠pH5.5，并在4℃下4小时转动
  17. 使用Costar Spin-X离心柱在4℃，20,000xg下过滤洗脱上清液15分钟。
  18. 将400μl洗脱液转移到新试管中。
  19. 加入1μl线性丙烯酰胺和1ml EtOH /异丙醇（1：1），涡旋，并在-80℃下孵育1小时以上。
  20. 在4℃和28,000×g离心30分钟
  21. 用冷的75％EtOH洗涤沉淀一次，然后用100％EtOH洗涤一次
  22. 在室温下将沉淀物空气干燥约10分钟。
13. 反转录
  1. 将沉淀重悬在7μl无核酸酶的D.W中，并将重悬的样品转移到新管中。
  2. 将7μl5'/3'接头连接的AGO-Cliped RNA与1μl10μMRNA RT引物，5μl2 mM dNTP混合。
  3. 将混合物加热至65℃5分钟，并在冰上孵育至少1分钟
  4. 通过短暂离心收集管的内容物。
  5. 加入4μl的5x First-Strand缓冲液，1μl的0.1 M DTT，1μl的 SUPERase?在RNase抑制剂中，1μlSuperScript?III RT，总体积为20μl
  6. 通过轻轻地上下轻轻混合。
  7. 在55℃孵育1小时
  8. 通过在70℃加热15分钟使反应失活。
14. PCR
  1. 准备PCR混合物。
  2. 使用以下热程序运行PCR反应：
    1. 98℃，30秒
    2. 98℃，10秒/（3）55℃，30秒/（4）72℃，10秒（N个循环）
    3. 72℃，10分钟
    4. 4℃，∞
    注意：要优化循环次数，请为每个样品准备一个样品：N = 15,20和25。
  3. 加入1μl线性丙烯酰胺，20μl3 M乙酸钠（pH 5.5），130μlD. W.和800μlEtOH：异丙醇（1：1）。
  4. 彻底涡旋并在-80℃下孵育至少1小时
  5. 在4℃和28,000×g离心30分钟
  6. 用冷的75％EtOH洗涤沉淀一次，然后用100％EtOH洗涤一次
  7. 在室温下将沉淀物空气干燥约10分钟。
  8. 准备预制6％TBE凝胶
  9. 将沉淀重悬于10μlD.W。并加入2μl6x DNA上样缓冲液（含溴酚蓝+二甲苯蓝）
  10. 将样品和低分子量DNA梯子装入制备凝胶并在100V下运行，直到溴酚蓝（较低）染料达到底部
  11. 通过温和摇动10分钟，将凝胶在含EtBr的1x TBE中染色
  12. 识别并切割136?173 bp扩增子的凝胶（图4）。它应包含侧翼为5'-和3'-引物的18?55nt的剪接插入片段序列。通常，如果PCR的底物的量是足够，它可以在20个周期可视化清楚在136?173的大小 bp区域。
  13. 加入400μl0.3M醋酸钠pH5.5，在4℃下旋转过夜
  14. 使用Costar Spin-X离心柱在4℃，20,000xg下过滤洗脱上清液15分钟。
  15. 将400μl洗脱液转移到新试管中。
  16. 加入1μl线性丙烯酰胺和1ml EtOH /异丙醇（1：1），涡旋，并在-80℃下孵育1小时以上。
  17. 在4℃和28,000×g离心30分钟
  18. 用冷的75％EtOH洗涤沉淀一次，然后用100％EtOH洗涤一次
  19. 在室温下将沉淀物风干约10分钟
  20. 用适当体积的水（?20μl）重悬沉淀
    
    图4. PCR产物的可视化。应该是的区域由剃刀切除由红色虚线矩形表示。过度放大在≥22个PCR循环中经常发现PCR（过度PCR）产物 AGO-CLIP-seq执行良好。我们建议至少收集五个 PCR反应收集足够大的量用于文库构建 ?和高通量测序。
mRNA-seq和smallRNA-seq的文库构建
1. mRNA-seq的文库
  注意：mRNAseq文库可以按照先前描述的（Guo 等人，2010）进行修改。
  1. 使用五个培养皿之一（来自步骤A2b），根据制造商的说明使用Trizol试剂提取总RNA。
  2. 使用Dynabeads mRNA富集poly（A）+ RNA DIRECT?纯化试剂盒根据制造商的说明用5μg总RNA
  3. 使用NEBnext Magnesium RNA Fragmentation模块将0.2μg富含寡（dT）的RNA片段化。
  4. 使用南极磷酸酶在37℃下使断裂的RNA脱磷酸化1小时，并在70℃热灭活5分钟。
  5. 使用[γ-^{32 P] ATP和PNK标记去磷酸化RNA的5'-末端。}
  6. 从10％TBE-尿素凝胶纯化标记的35-55nt RNA片段
  7. 连接3'-衔接子并凝胶纯化连接的产物
  8. Ligation 5'-adapter并凝胶纯化结合的产物
  9. 进行逆转录（RT）和PCR。
  注意：衔接子，RT引物和PCR引物的连接是相同的为AGO-CLIP-seq文库制备以最小化潜在偏差和 ?允许在与AGO-CLIP-seq相同的测序平台上加载。接头连接的RNA进行逆转录和PCR扩增 ?描述的AGO-CLIP-seq的协议，除了cDNAs 在PCR中扩增17个循环。
2. smallRNA-seq的库：
  1. 使用所述的方法制备小RNA-seq文库 mRNA-seq文库，除了初始RNA收获的差异步骤：将5μg总RNA在10％TBE-尿素凝胶中电泳， ?纯化18-25-nt RNA种类用于进一步的步骤。
高通量测序
扩增的cDNA文库通过使用Illumina HiSeq2000以单次读取/四链体进行1×51个循环而测序。
数据处理和生物信息学
1. 预处理：
  1. 序列读取在读取之前进行预处理通过使用CutAdap（v.1.2.1）去除衔接头序列进行比对， fastX_artifacts_filter in FASTX-Toolkit（v。0.0.13.2， http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/）来过滤工件读取，和然后删除低质量的读序列。 CutAdap中使用的选项软件是"-m 17 --match-read-wildcards -O 10 -e 0.10"。
  2. 至计算映射到人rRNA或tRNA的读数的相对分数，将Bowtie2（v。2.1.0）比对软件应用于rRNA参考来自Rfam的序列（http：//rfam.samger.ac.ur/）（Burge等人，2013）和 ?来自GtRNAdb（http://gtrnadb.ucsc.edu/）的tRNA参考序列（Chan和Lowe，2009）。
  3. 为了尽可能全面，扩展这些序列集以包括在中发现的同源序列人类基因组（hg19）与BLAST +（v.2.2.27）软件（Camacho等人， 2009）。
2. 基因组和数据库：
  1. 所有比对和分析基于人hg19参考序列和HCMV Towne基因组进行
  2. 基因组注释，lincRNAs，miscRNAs，mt tRNAs， snoRNA和snRNA从UCSC基因组表浏览器下载和人类的Ensembl中的BioMart和HCMV的NCBI。人类和HCMV miRNA的miRNA注释是从中下载的 miRBase21（http://mirbase.org/）。
  3. 因为大多数HCMV编码 miRNA通过使用其他种类的HCMV毒株的研究来注释 ?注释位置不与Towne基因组一致是用注释基于AD169基因组的miRNA进行的 HCMV Towne和miRNA获得HCMV miRNA注释的注释 ?（Stark等人，2012）。
3. 基因表达测量：
  1. 使用Tuxedo套件计算mRNA和miRNA的表达水平。
  2. 要确定基因表达水平，应用Tophat2（v。2.0.9）与"--no-coverage-search --b2-very-sensitive --no-nevel-junc"选项和带有"-q - no-update-check"选项的袖扣（v。2.1.1）计算RPKM（每百万转录物每千碱基读数）碎片映射）分数。
  3. 应用Bowtie2（v。2.1.0）with"-k 101， --score-min C，0,0（无失配）或--score-min C，-8,0（对于1个失配） -mp 8,8 --np 8 - 非敏感性"选项来确定miRNA 表达水平与多达一个不匹配以计算RPM（读数/ 百万读取映射）分数。
  4. 量化表达水平来自AGO-CLIP-seq数据的miRNA与小RNA测序数据类似。一个额外的不匹配（--score-min C，-16,0选项在Bowtie2）为可以允许AGO-CLIP-seq比对，因为AGO-CLIP-seq更多容易出错。
4. AGO结合位点检测：
  1. 由于AGO-CLIP-seq读数指示AGO-RNA相互作用，AGO-CLIP-seq读数簇（"峰"）表明AGO结合位点。
  2. 为了排除随机AGO-RNA相互作用，峰检测方法是设计以测量显着富集的AGO-CLIP-seq读数 ?到mRNA-seq读取使用Fisher精确检验。
    注意：此测试比较给定60-bp和1-Mbps局部的表达水平背景区域分别在AGO-CLIP-seq和mRNA-seq。
  3. 得到的P值用于定义峰值区域并评估峰值的重要性。
    1. 阅读准备和对齐
      1.收集非miRNA读数，并从AGO-CLIP-seq数据中过滤。
      2.）将AGO-CLIP-seq读数和mRNA-seq读数对齐到人类基因组上使用具有较不严格模式的TopHat2（加上-b2-score-min L，-0.6， 0.9在mRNAseq选项中），以允许稍微更多的测序错误 AGO-CLIP-seq。
      3.）对于每个基因组位置，计算AGO-CLIP-seq和mRNA-seq的比对读数以鉴定峰区。
      4.）由于mRNA测序在转录物上具有覆盖偏差，对于每个转录物采用对于转录物长度的平均值识别峰。
    2. 峰值检测
      1.检测显着来自AGO-CLIP-seq数据的峰，应用使用映射的Fisher精确检验读取60 bp的候选峰区域和周围的1 Mbp 背景区域。
      2.）窗口大小由AGO确定足迹跨越大约60bp（Chi等人，2009），背景是设置得足够大。
      3.）使用Q-VALUE（v。1.1）调整p值来自Storey实验室（http://genomics.princeton.edu/storeylab/qvalue）具有用于多重比较校正的默认设置。
      4.）将假发现率（FDR）小于0.01的峰定义为显着的。
      5.）在合并峰位点合并重叠峰以避免冗余。
      6.）使用位于人外显子区域的峰用于分析人mRNA上的AGO结合位点
    3. 增加CLIPseq约束：
      为了检测mRNA中3'-UTR上特异性miRNA的靶位点，检查峰位点是否包括具有规范的种子配对位点种子位点（8mer，7mer-A1,7merm8和6mer）的人和病毒通过搜索定义的峰区域（60 bp，更长的合并 ?峰）。基于此搜索，在没有种子的情况下的峰可以排除其区域中的配对位点。
      2.）识别更多强大的病毒miRNA靶标，"增加CLIP-seq"约束是应用，表示作为富集的AGO-CLIP-seq读数的水平相对于先前的病毒感染时间。
      3.）测量对于给定的microRNA靶位点的富集得分，我们引入a 相对分数，称为"ACE分数（AGO-CLIP-seq Enrichment分数）"。 ACE评分定义为给定的标准化计数的对数比时间点到病毒后的上一时间的归一化计数感染（图5）。
      
      图5. ACE评分计算方案。ACE评分公式和峰值集群站点的示例从参考文献（Kim等人，2015）中说明和改编。 RPKM，读每千万基因的转录物每百万片段映射。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）

137 mM
NaCl

2.7 mM
KCl

10 mM
Na HPO ₄

2 mM
KH ₂ PO ₄
裂解缓冲液

50 mM
Tris-HCl（pH 7.4）

100 mM
NaCl

1％
NP-407

0.1％
SDS

0.5％
脱氧胆酸钠
高盐缓冲液

50 mM
Tris-HCl（pH 7.4）

1兆
NaCl

1 mM
EDTA

1％
NP-40

0.1％
SDS

0.5％的
脱氧胆酸钠
洗涤缓冲液

20 mM
Tris-HCl（pH 7.4）

10 mM
MgCl 2

0.2％
吐温-20
CIP混合

10微升
10x NE缓冲区3

5微升
碱性磷酸酶，小牛肠（CIP）

3微升
在RNase抑制剂中

82微升
无核酸酶蒸馏水（D.W。）至100μl终体积

3'-连接混合物

100 pmol	3'-衔接子（RA3）（1μl100μM衔接子）
10微升	10×T4 RNA连接酶缓冲液（无ATP）
3微升	T4 RNA连接酶截短的K227Q
3微升	SUPERase?在RNase抑制剂中
30微升	50％PEG8000
53微升	无核酸酶D.W至100μl终体积

热PNK混合物

5微升
10mCi/ml [μ-γ-32P] ATP

8微升
10x T4 PNK缓冲区

3微升
T4 PNK缓冲区

2微升
在RNase抑制剂中

62微升
无核酸酶D.W至80μl终体积
0.1％PBS-T

137 mM
NaCl

2.7 mM
KCl

10 mM
Na HPO ₄

2 mM
KH ₂ PO ₄

0.1％（v/v）
吐温-20
PK缓冲区

100 mM
Tris-HCl（pH 7.4）

50 mM
NaCl

10 mM
EDTA
PK混合物

100微升
PK缓冲区

100微升
20mg/ml蛋白酶K
PK /尿素缓冲区

100 mM
Tris-HCl（pH 7.4）

50 mM
NaCl

10 mM
EDTA

7 M
尿素

5'-连接混合物

8.5微升	重悬样品
1微升	5'-衔接子寡核苷酸
2微升	10x T4 RNA连接酶缓冲液（含ATP）
6微升	50％PEG 8000（NEB）
1微升	0.1％BSA（TaKaRa T4 RNA连接酶试剂盒提供）

PCR混合物

2微升	RT产品（模板）
2微升	5'-引物（10μM）
2微升	3'-引物（10μM）
10微升	5x HF缓冲液
5微升	2 mM dNTPs mix
0.5μl	phusion聚合酶
28.5微升	总量为50微升

6x DNA加载缓冲液

10 mM
Tris-HCl（pH 7.6）

0.03％
溴酚蓝（w/v）

0.03％
二甲苯蓝藻FF（w/v）

60％
甘油

60 mM
EDTA
TBE（Tris-硼酸盐-EDTA）
1. 准备一个5升储备溶液在1升的D. W .:
  
  54克
  Tris碱
  
  27.5克
  硼酸
  
  20ml
  0.5 M EDTA（pH 8.0）
2. 0.5x工作溶液是45mM Tris-硼酸盐/1mM EDTA。

致谢

我们要感谢大韩民国集团（首尔国立大学生物科学学院，韩国首尔）为生物信息学分析的发展和技术支持。该协议已经从我们以前的研究（Kim等人，2015年）改编。这项工作得到科学，ICT和韩国未来规划部（K.A。）基础科学研究所的IBS-R008-D1的支持。

参考文献

Burge，S.W.，Daub，J.，Eberhardt，R.，Tate，J.，Barquist，L.，Nawrocki，E.P.，Eddy，S.R.，Gardner，P.P.and Bateman， Rfam 11.0：10年的RNA家族。 Nucleic Acids Res < em> 41（数据库问题）：D226-232。
Britt，W. J.（2010）。人类巨细胞病毒：繁殖，定量和储存。 Curr Protoc Microbiol 第14章：单位14E 13.
Camacho，C.，Coulouris，G.，Avagyan，V.，Ma，N.，Papadopoulos，J.，Bealer，K.and Madden，T.L。（2009）。 BLAST +：体系结构和应用。 BMC Bioinformatics 10：
Chan，P.P。和Lowe，T.M。（2009）。 GtRNAdb：在基因组序列中检测到的转移RNA基因的数据库核Acids Res 37（数据库问题）：D93-97。
Chi，S.W.，Zang，J.B.，Mele，A。和Darnell，R.B。（2009）。 Argonaute HITS-CLIP解码microRNA-mRNA相互作用图。 em> 460（7254）：479-486。
Guo，H.，Ingolia，N.T.，Weissman，J.S。和Bartel，D.P。（2010）。哺乳动物微小RNA主要用于降低靶mRNA水平。自然 466（7308）：835-840。
Kim，S.，Seo，D.，Kim，D.，Hong，Y.，Chang，H.，Baek，D.，Kim，V.N.，Lee，S.and Ahn，K。生产性人巨细胞病毒感染过程中微小RNA介导的宿主 - 病毒串扰的时空格局。 em> Cell Host Microbe 17（6）：838-851。
Stark，T.J.，Arnold，J.D.，Spector，D.H。和Yeo，G.W。（2012）。在人类巨细胞病毒感染期间对病毒和宿主小RNA的高分辨率分析和分析。 J Virol 86（1）：226-235。