材料和试剂

T25细胞培养瓶（25cm 2）（Greiner Bio-One GmbH，目录号：690160）。
24孔板（Greiner Bio-One GmbH，目录号：662160）
封面眼镜（Marienfeld-Superior，目录号：0111550）
玻璃巴斯德移液管（Marienfeld-Superior，目录号：3233050）
Filtropur S 0.2注射器过滤器（Sarstedt AG，目录号：83.1826.001）
Syringe Omnifix ^?（B. Braun Medical，目录号：4616103V）
具有硅胶垫的解剖皿（培养皿）（94×16mm）（Sigma-Aldrich，目录号：Z617636）
Greiner培养皿（35×10mm）（Sigma-Aldrich，目录号：P5112）
15ml Cellstar离心管（Greiner Bio-One GmbH，目录号：188261）
小鼠（2至6个月）（菌株：C57BL/6）
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：P2636）
HEPES（AppliChem GmbH，目录号：A3268）
（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：6943.1）
四硼酸钠（Na 2 BO 4 O 7）（Sigma-Aldrich，目录号：221732）
牛血清白蛋白（PAA，目录号：K41-001）
HBSS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：14175-053）
Neurobasal -A培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10888022）
B-27 补充（50x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：17504-044）
L-谷氨酰胺（200mM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup> TM，目录号：25030）
青霉素/链霉素（100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15140）
最低必需培养基（MEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：31095-029）
D（+） - 葡萄糖（C 6 H 12 S 6 O 6）（Merck Millipore Corporation，目录号：108337）
胶原酶II（Worthington Biochemical Corporation，目录号：LS004176）
马血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：26050-88）
来自牛胰腺的胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T1426）
β神经生长因子（β-NGF）（Preprotec，目录号：450-01）
硼酸缓冲液（参见配方）
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（PLL）储备溶液（见配方）
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（PLL）工作溶液（参见配方）
解离解决方案（参见配方）
30％葡萄糖储备溶液（见配方）
0.5％BSA封闭溶液（参见配方）
DRG神经元培养基（见配方）
DRG制剂（见配方）
胶原酶II溶液（参见配方）
2％胰蛋白酶原液（见配方）

设备

CO 2 sub培养箱（37℃，5％CO 2浓度和95％相对湿度）（Labotect，型号：C-200）
层流工作台（Heraeus Holding）
立体显微镜（Carl Zeiss，型号：Stemi 2000C）
冷光源（配备有柔性双分支光导）（Carl Zeiss，型号：CL1500ECO）
剪刀
1. 标准剪刀（Fine Science Tools，目录号：14002-12）
2. 学生弹簧剪刀（Fine Science Tools，目录号：91500-09）
3. 斜角弹簧剪刀（Fine Science Tools，目录号：15006-09）
镊子
1. Dumont＃7b医用镊子（Fine Science Tools，目录号：11270-20）
2. Dumont＃4镊子（Fine Science Tools，目录号：11242-40）
3. Dumont＃5镜面镊子（Fine Science Tools，目录号：11252-23）
本生燃烧器Fireboy plus（Integra Biosciences）
玻璃巴斯德移液管（Marienfeld-Superior，目录号：3233050）
巴斯德移液管滴管球（Thermo Fisher Scientific，目录号：03-448-25）
离心机5810R（Eppendorf AG）
Pipetman P20/P200/P1000（Gilson）

程序

第1天：制备解离溶液并预冷至4℃
用聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（PLL）包被T25细胞培养瓶。为此目的，将1ml PLL溶液（1mg/ml，在硼酸盐缓冲液中）加入到细胞培养瓶中，并在37℃温育过夜。或者，将8个盖玻片置于无菌24孔板的孔中，并在37℃下与PLL温育过夜。
第2天：吸出PLL溶液，并用无菌水漂洗细胞培养瓶三次。将烧瓶留在空气中，在层流罩中干燥15分钟
然后将烧瓶与5ml DRG神经元培养基预温育并置于培养箱中
通过向上和向下移动0.5％BSA封闭溶液三次来封闭无菌玻璃移液管。阻塞玻璃巴斯德移液管存放在层流工作台中，直到同一天使用
剪刀和镊子在70％乙醇中消毒30分钟，然后风干
通过颈脱位法杀死小鼠，并用一对标准剪刀快速解剖脊髓。为了准备脊髓，用标准剪刀在腹侧中线切开皮肤。将器官从胸腔和腹腔中取出。使用标准剪刀，两个长切口紧邻左右脊柱。尾巴和头骨被删除。最后，剩余的椎旁肌大部分被移除以暴露脊柱
使用立体显微镜小心地移除所有脊柱水平的DRG并收集在置于冰上的10-cm解剖皿中的10ml HBSS中。详细地，用学生弹簧剪刀将脊柱首先切割成三个大致相等的块，以改进随后的处理。然后，将学生弹簧剪刀的一个刀片从腹侧插入椎管中。剪刀的另一刀片在其腹侧上放置在脊柱外部。沿脊柱形成两个切口，如图1A-C和图2的方案所示，在腹侧上的中线的一个左侧和一个右侧。脊柱的切除部分被提起，脊髓从柱（参见图1D-F）。 DRG是感觉神经元的体细胞簇，并且紧密地沿着脊髓的背根定位。 DRGs位于椎间孔中并且具有长的远端和近端过程（假性极性神经元）。 DRG的特征在于圆形和??与神经纤维束的白色不同的透明外观。学生弹簧剪刀，杜蒙＃7b和＃4钳子用于仔细隔离三个脊髓的每个的暴露的神经节。
将分离的DRG收集在填充有5ml DRG制备培养基的35-mm培养皿中。将盘子保存在冰上。根据实验者的专业知识获得约20至40个神经节
围绕神经节的神经束的结缔组织的薄层在一对弹簧剪刀和Dumont＃5镜面镊子的帮助下被去除。然后将DRG转移到在冰上填充有DRG制备培养基的第二个35-mm培养皿中。
制备胶原酶-II溶液并预热10分钟至37℃。
将分离的DRG在玻璃巴斯德吸管的帮助下在层流工作台下转移到15-ml离心管中。
在DRGs在管底部上沉降后，除去上清液并弃去。
用5ml预冷却和无菌的离解溶液冲洗DRG
再次，除去上清液。如步骤13和14所述，DRG总共洗涤三次，每次用5ml离解溶液。
在最后一次洗涤步骤后，留下2ml解离溶液并加入1ml胶原酶-II溶液
DRG在37℃孵育1小时，同时每10分钟轻轻摇动隼
将2％胰蛋白酶原液的等分试样解冻并预热20分钟至37℃。
加入150μl活化胰蛋白酶
将DRG在37℃下孵育另外9分钟，同时每3分钟轻轻摇动猎鹰。
小心地除去上清液并用步骤13和14中所述的5ml离解溶液洗涤
在最后一次洗涤步骤后，留下1.5ml离解溶液
为了获得单细胞，用在步骤5中制备的玻璃巴斯德移液管解离DRG。两个玻璃巴斯德移液管被火抛光以获得较小的开口。使用具有1.1-1.3mm原始开口直径的玻璃移液管，上下移动大约10次DRG，直到溶液呈现均匀。然后使用具有较小直径的（火抛光的）巴斯德移液管，并将溶液研磨8次。最后，使用非常小直径（火抛光）的巴斯德移液管3次
将单细胞悬浮液在160×g离心5分钟。离心机的减速度减少到"3"（在10个制动斜坡中），以避免在离心机停止时小的和脆弱的细胞团分散。
从细胞沉淀中除去上清液。
将补充有10％马血清的DRG神经元培养基加入细胞沉淀;将细胞重悬浮并在160×g离心5分钟。离心机的减速度再次设置为"3"。
小心除去上清液，用1000μl移液管将细胞重悬浮于DRG神经元培养基中
将从一只小鼠获得的细胞（大约50,000至100,000个细胞）接种在一个T25细胞培养瓶中，或者在8个盖玻片（10mm直径）上，并置于37℃，5％CO 2大气层。
铺板后30分钟，用补充有β-NGF（50ng/ml）的新鲜DRG细胞培养基替换培养基。将5ml体积加入到T25烧瓶中或者对于24孔板的每个孔加入0.5ml。
原代培养物保持长达三周。每3至5天更换三分之一体积的新鲜补充了β-NGF（50ng/ml）的DRG神经元培养基。图3显示培养的DRG神经元在铺板后不同时间点的明视场显微镜图像，证明培养物中DRG神经元过程的进行性生长。神经元特异性III类β-微管蛋白的染色（参见图4）进一步说明了补充培养基的由β-NGF刺激的培养的DRG神经元的特征形态。

代表数据

图1. DRG解剖图。 A.显示脊髓的腹侧。公元前。沿脊髓的腹侧形成两个切口，一个左（B）和一个右（C）。 D-E。脊柱的切除部分被抬起。 F.从柱中除去脊髓。 G.暴露神经节并（H）从周围组织小心地分离。 I.箭头指向具有其特有的圆形，透明质外观和其近端过程的一部分的孤立的背根神经节。

图2.脊髓准备用于DRG隔离的示意图。对于脊髓管的开放，进行两个切口（红色虚线）。显示背侧的感觉神经节的位置。

图3.培养中分离的原代DRG神经元。在体外培养3天后，（B）在第1天体外，（C）在体外培养第2天时的原代小鼠背根神经节神经元（A）和（D）在第5天在体外。比例尺：10μm

图4.荧光标记的原代DRG神经元的共焦图像 A.在培养4天后的原代小鼠背根神经节神经元。固定的细胞用神经元特异性III类β-微管蛋白染色（克隆TUJ1，Stemcell technologies，1：500）。 B.用Hoechst 33258染色细胞核。C.合并的图像。比例尺：100μm

食谱

硼酸盐缓冲液
1.24g H sub 3 BO ₃
1.90g Na 2 B 4 SubO 4 7 / 将ddH ₂ O添加到400 ml
储存在4°C长达1年
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（PLL）储液
将100mg PLL溶解在10ml ddH 2 O中等分，并储存在-20°C长达6个月
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（PLL）工作溶液
将1ml PLL储备液（10mg/ml）与9ml硼酸盐缓冲液混合过滤除菌（0.20μm过滤器）并在4℃下储存最多4周
解离溶液
将500ml HBSS与3.5ml HEPES（1M，pH 7.25）混合加入5ml青霉素/链霉素（100x）
新鲜制备用于每个实验的溶液
葡萄糖储备溶液（30％）
将30g C 6 H 12 SO 6溶解在50ml ddH 2 O中。< br /> 将ddH ₂ O加到100 ml
过滤灭菌（0.20μm过滤器）并在4℃下贮存最多6个月
0.5％BSA封闭溶液
0.5g BSA
将HBSS添加至100 ml
过滤灭菌（0.20μm过滤器），并在4°C下保存最多1年
DRG神经元培养基
100μlL-谷氨酰胺（200mM） 400μlB-27 ^?补充（50x）
200μl青霉素/链霉素（100x）
将Neurobasal ^？ -A培养基加至20ml ml / 4℃保存2周
DRG制剂培养基
140μlHEPES（1M，pH 7.25）
200μl葡萄糖储备溶液（30％）
100μl青霉素/链霉素（100x）
将最小必需培养基（MEM）加至10ml ml / 新鲜制备用于每次实验的培养基
胶原酶II溶液
将10 mg胶原酶-II溶解在1 ml离解溶液中
新鲜制备用于每个实验的溶液
2％胰蛋白酶原液
将100mg胰蛋白酶溶解在5ml HBSS中等分，并在4°C下存储最多6个月

致谢

这项工作得到Deutsche Forschungsgemeinschaft对I.K.（KU 1587/4-1），C.A.H。（HU 800/6-1，RTG1715），T.H。（RTG 1715）的赠款的支持。根据由耶拿大学动物福利委员会制定的指南进行动物护理和实验程序。

参考文献

Khaminets，A.，Heinrich，T.，Mari，M.，Grumati，P.，Huebner，AK，Akutsu，M.，Liebmann，L.，Stolz，A.，Nietzsche，S.，Koch，N.，Mauthe M.，Katona，I.，Qualmann，B.，Weis，J.，Reggiori，F.，Kurth，I.，Hubner，CA和Dikic，I。（2015）。通过选择性自噬调节内质网周转。自然 522（7556）：354-358。