材料和试剂

无菌注射器过滤器（Merck Millipore Corporation，Millex，目录号：SLGV033RS）
冰
拟南芥生物型Columbia（Col-0）的种子
大肠杆菌（BL21）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：C6000-03）
pGEX-4T-3表达载体（GE Healthcare，Amersham，目录号：28-9545-52）
农杆菌（GV3101）
LB培养基（Caisson Laboratories，目录号：LBP01-500GM）
Murashige和Skoog（MS）培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M5524）
氨苄青霉素（Beyotime，目录号：ST007）
异丙基-b-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Sigma-Aldrich，目录号：367-93-1）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：57-50-1）
氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：1310-58-3）
Bacto琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：9002-18-0）
乙醇
NP40（Sigma-Aldrich，Abcam，目录号：9016-45-9）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：31434）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：7447-40-7）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：7558-79-4）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：7778-77-0）
盐酸（HCl）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：60-00-4）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：56-81-5）
L谷胱甘肽还原（Sigma-Aldrich，Abcam，目录号：70-18-8）
超纯水
液体N <2>
GST ^。 Bind ^TM Resin（Merck Millipore Corporation，Novagen，目录号：70541）
蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics，目录号：11873580001）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：15527）
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：77-86-1）
GFP-Trap（ChromoTek，GFP-Trap _M）
HDAC活性比色测定试剂盒（BioVision，目录号：K331-100）
HeLa核提取物（Biovision，目录号：1641-1）
曲古抑菌素A（Sigma-Aldrich，目录号：58880-19-6）
Bradford蛋白测定试剂盒（Beyotime，目录号：P0006）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
苯基甲磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
Boc-Lys（Ac）-pNA
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）
GST洗脱缓冲液（见配方）
植物蛋白提取缓冲液（见配方）
GFP洗涤缓冲液（参见配方）
GFP洗脱缓冲液（见配方）
HDAC分析缓冲液（Biovision）（参见配方）
HDAC底物（比色底物）（参见配方）

设备

植物生长室（Panasonic Healthcare Corporation，型号：MLR-352）
无菌通风橱（Alibab，Airtech，型号：VS-1300L）
高压灭菌器（HIRAYAMA，型号：HVE-50）
离心机（Eppendorf AG，型号：5418R和5810R）
Shaker（Eppendorf AG，型号：New Brunswick Innova 40）
超声波发生器（SONICS& MATERIALS，型号：VCX130）
分光光度计（Molecular Devices Spectra Max）

程序

表达和纯化重组HDACs。大肠杆菌
1. 按照Luo等人（2015）所述，将HDACs（例如HDA5）的蛋白质编码序列插入载体pGEX-4T-3中。
2. 将质粒转化为E。大肠杆菌（BL21），并在含有氨苄青霉素（100μg/ml）的新鲜琼脂平板上选择。
3. 接种单个菌落。大肠杆菌在2ml LB培养基中，在37℃下旋转过夜
4. 转移2ml E。大肠杆菌培养物在250ml LB培养基中在37℃剧烈通气并培养直到OD 600达到0.4-0.6。
5. 添加终浓度为0.1mM 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）在28℃下剧烈通气孵育约6-10小时
6. 离心机 ?细胞在4℃下6,000×g离心10分钟，并除去上清液。然后用25ml细胞裂解缓冲液（1x PBS）重悬沉淀
7. 超声处理重悬的溶液15秒，40％功率为40 次。在每次超声处理之间，将溶液置于冰上1 ?min。
8. 超声处理后，将可溶性细胞提取物应用于GST亲和柱
9. 通过加入5ml×3的洗涤缓冲液（1×PBS）从树脂中洗涤未结合的蛋白质
10. 通过加入4ml洗脱缓冲液从树脂中洗脱结合的蛋白质
11. 将洗脱的蛋白储存在-20℃。
HDAC在转基因植物中的表达和纯化
1. 将克隆HDAC cDNA（例如HDA5）克隆到pK7WGFP二元载体中。
2. 通过电穿孔将所得质粒转化到GV3101土壤杆菌菌株中
3. 通过花浸渍将转化的土壤杆菌引入拟南芥植物中（Zhang，et al。，，2006）。
4. 在含有卡那霉素（50mg/L）的1/2MS培养基上选择推定的转化体。
5. 筛选后，通过植物蛋白提取总可溶性蛋白提取缓冲液从转基因植物，然后在4℃离心 13,000 x g 10分钟。
6. 将悬浮液转移到新鲜的Eppendorf管中，并在4℃和13,000×g下再次离心10分钟。
7. 通过GFP-Trap纯化GFP-HDAC重组蛋白制造商的说明。加入25μl珠浆液到可溶性蛋白质提取。
8. 在4℃下翻滚翻滚1小时。
9. 磁力分离珠直到上清液澄清。弃去上清液并重复洗涤两次
10. 通过加入50μl，0.2M甘氨酸（pH2.5）洗脱结合的蛋白质
11. 将上清液转移到新鲜的Eppendorf管中，加入5μl1M Tris碱（pH 10.4）中和。
12. 通过Bradford测定法确定纯化蛋白质的蛋白质浓度（He，2011）。
HDAC酶活性测定
1. 放置85微升纯化的蛋白质在96孔板，然后加入10微升 10x HDAC测定缓冲液和5μl比色底物至每个孔并在37℃孵育1小时。 HeLa核提取物（4μg）用作 ?阳性对照。使用HDAC抑制剂TSA来证明脱乙酰活性的特异性
2. 通过加入10μlLys显色剂停止反应，并将板在37℃孵育30分钟。
3. 在405nm下用分光光度法测量HDAC活性。

代表数据

有代表性的数据，请参阅Luo等人的论文。（2015）。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）（无菌过滤）
10mM Na 2 HPO 4
2mM KH 2 PO 4 sub/
137 mM NaCl 2.7 mM KCl
pH 7.4
GST洗脱缓冲液（无菌过滤）
50mM Tris-HCl
10 mM还原型谷胱甘肽
pH 8.0
植物蛋白提取缓冲液（无菌过滤）
10mM Tris/Cl（pH7.5） 150mM NaCl 0.5mM EDTA 0.5％NP40
GFP洗涤缓冲液（无菌过滤）
10mM Tris/Cl（pH7.5） 50mM NaCl 0.5mM EDTA
GFP洗脱缓冲液（无菌过滤）
200mM甘氨酸（pH 2.5）
HDAC测定缓冲液
15mM Tris-HCl（pH8）
250μMEDTA
250μMNaCl
10％甘油
HDAC基材
10mM Boc-Lys（Ac）-pNA

确认

这项工作得到了中国国家自然科学基金（31200965）和中国博士后科学基金（2014M562220）的支持。组蛋白脱乙酰酶活性测定从Biovision HDAC活性比色测定试剂盒的说明修改。

参考文献

他，F.（2011）。 Bradford蛋白质测定生物协议 Bio101：e45。
Luo，M.，Tai，R.，Yu，C.W.，Yang，S.，Chen，C.Y.，Lin，W.D.，Schmidt，W.and Wu，K。拟南芥中组蛋白脱乙酰酶HDA5对开花时间的调节 a> Plant J 82（6）：925-936。
Zhang，X.，Henriques，R.，Lin，S.S.，Niu，Q.W.and Chua，N.H。（2006）。农杆菌介导的拟南芥的转化使用花浸法。/a> Nat Protoc 1（2）：641-646。