材料和试剂

5ml注射器（BD biosciences，目录号：309646）
25 G x 5/8针（BD biosciences，目录号：305122）
15ml锥形管（Corning，Falcon，目录号：352097）
50ml锥形管（USA Scientific，目录号：1500-1811）
60×15mm培养皿（Corning，Falcon，目录号：351007）
无菌48孔板，组织培养处理（Greiner Bio-One GmbH，目录号：677180）
5ml和10ml血清移液管
OP9-DL1细胞（不可商购，必须私人请求来自J.C.Zuniga-Pflucker，University of Toronto，Sunnybrook Research Institute）
OP9-DL1基质细胞（由Dr.J.Zuniga-Pflucker制造并获得的OP9-DL1）
抗体（均购自eBiosciences，Affymetrix）
1. 封闭抗体抗CD16/CD32功能级纯化（克隆93）（eBioscience，Affymetrix，目录号：16-0161）
2. 抗小鼠谱系抗体（根据供应商的浓度说明书），荧光染料与FITC或APC（Lineage 标记），APC-Cy7（IL7Rα），PerCP eFluor 710（Flt-3）和PE-Cy7 （Ly6A/E）
  CD4（克隆6K1.5）
  CD8α（53-6.7）
  CD3ε（145-2C11）
  CD11b（M1/70）
  CD11c（N418）
  CD19（1D3）
  B220（RA3-6B2）
  Gr-1（RB6-8C5）
  Nk1.1（PK136）
  Ter-119（TER-119）
  （30-H12）
3. 限定细胞表面抗体的常见淋巴祖细胞（根据供应商说明的浓度）
  Flt3（A2F10）
  IL7Rα（A7R34）
  Ly6A/E（Sca-1）（D7）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：14190-144）
Dulbecco改良的Eagle培养基，高葡萄糖（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11965-092）
最小必需培养基（MEM）α，无核苷（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：12561-049）
胎牛血清（FBS）（Omega Scientific，目录号：FB-01）
100x青霉素 - 链霉素（PSA）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10378-016）
叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2002）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M7522）
丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11360-070）
MEM非必需氨基酸（Mediatech，Corning glutagro ^TM，目录号：25-025-CI）
HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15630）
胰蛋白酶-EDTA（0.05％），酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25300-054）}
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A8022）
重组小鼠白细胞介素7（IL-7）载体（Biolegend，目录号：577802）
重组小鼠干细胞因子（SCF）载体（Biolegend，目录号：579702）
重组小鼠IL-33载体（Biolegend，目录号：580504）
丝裂霉素C（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-3514）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
NaN ₃
FACS缓冲区（参见配方）
无菌分选缓冲液（参见配方）
先天淋巴细胞培养基（ILC培养基）（参见配方）
OP9-DL1介质（参见配方）

设备

无菌生物安全柜
孵育器设置在37℃，5％CO 2/h
Vortex Genie 2（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-812）
无菌FACS管
细胞分选仪（BD Biosciences，型号：FACS aria III）
Reichert Bright-Line Hemocytometer（Sigma-Aldrich，目录号：Z359629）
解剖剪刀（Roboz Surgical Instrument Co.，目录号：RS-5912）
钳（Roboz Surgical Instrument Co.，目录号：RS-5137）

程序

保持OP9-DL1细胞

解冻OP9-DL1
1. 准备OP9-DL1培养基（配方），并将10ml培养基置于15ml锥形管中
2. 从液氮中解冻准备的细胞瓶（在FBS + 10％DMSO，1ml总体积）通过将管置于37℃水浴中直到冰融化（约3分钟）
3. 使用1ml微量移液管将其加入到10ml OP9-DL1培养基中，并在室温下用235rcf离心5分钟。
4. 小心地取出培养基，只留下细胞沉淀。
5. 向管中加入10ml新鲜OP9-DL1培养基，用移液管上下移动以除去沉淀
6. 将该10ml加入到含有5ml OP9-DL1培养基的T75烧瓶中，总计15Bml。
7. 在37℃，5％CO 2孵育，每3-4天分裂1：3细胞。
传递OP9-DL1
注意：OP9-DL1细胞需要每3 - 4分割1：3，取决于生长动力学（70％-75％汇合或大约0.6-1×10 10个
在T75烧瓶中）。如果OP9-DL1达到高密度，它们必须是丢弃，因为它们将变成脂肪细胞。
1. 准备OP9-DL1培养基（配方），并将10ml培养基置于15ml锥形管中
2. 从T75烧瓶中取出培养基，加入7ml胰蛋白酶
3. 在37℃，5％CO 2下孵育约3分钟或直到OP9-DL1开始分离。
4. 小心取出胰蛋白酶，立即加入10 ml OP9-DL1培养基
5. 用10ml移液管洗涤烧瓶壁，以移除OP9-DL1细胞
6. 在25℃下离心260分钟×5分钟。
7. 除去上清液，加入1ml OP9-DL1培养基沉淀
8. 使用血细胞计数器计数细胞，并适当分裂（1 T75烧瓶应该有大约300,000个细胞）。
电镀OP9-DL1用于CLP的分化
1. 准备OP9-DL1培养基（配方），并将10ml培养基置于15ml锥形管中
2. 从T75烧瓶中取出培养基，加入7ml胰蛋白酶
3. 在37℃，5％CO 2下孵育约3分钟或直到OP9-DL1开始分离。
4. 小心取出胰蛋白酶，立即加入10 ml OP9-DL1培养基
5. 用10ml移液管洗涤烧瓶壁，以移除OP9-DL1细胞
6. 在25℃下离心260分钟×5分钟。
7. 除去上清液，加入1ml OP9-DL1培养基沉淀
8. 使用血细胞计数板和OP9-DL1板以30000细胞/孔的密度在48孔板中在200-300μl中计数细胞。
9. 允许细胞至少连接到表面6小时。
10. 向每个孔中加入1×丝裂霉素-C（200-300μl/孔，50μg/ml终浓度），并在37℃，5％CO 2下孵育25分钟。
11. 向每孔中轻轻加入1ml每孔温热的OP9-DL1培养基以洗去丝裂霉素-C。
12. 吸出介质并重复步骤C11，3次。
13. OP9-DL1饲喂层现在已准备好分离CLP。

第二部分。 CLP与ILC的区别

常见淋巴祖细胞（CLP）分离和免疫细胞化学
1. 准备包含3毫升FACS缓冲液（FACS缓冲液保持在4℃）的60×15毫米培养皿
2. 用含有5ml PBS的25G×5/8针制备5ml注射器
3. 通过切除近端移除鼠标后肢股骨和胫骨关节有两端骨开。去除股骨完全与两端切口
4. 用镊子握住骨头，通过在注射器中缓慢加入5 ml PBS将骨髓（BM）冲出骨头。
5. 通过用5ml注射器/25G针2x。
6. 将细胞（8ml）加入15ml锥形管中
7. 在25℃，260×g离心细胞5分钟。
8. 重悬在10毫升无菌分选缓冲液在4°C并计数细胞通过使用血细胞计数器。细胞的浓度取决于制造商 ?抗体染色说明书。这里，测试定义为1×10 6个细胞/测试，并且以200μl/测试的体积进行。
9. 通过用冰上的CD16/CD32预孵育细胞（1×10 6个细胞/测试）10分钟来阻断。
10. 使用"抗体"下列出的指定抗体按照制造商说明对细胞表面分子染色。
11. 在4℃孵育30分钟。
12. 通过加入3ml无菌分选缓冲液洗涤细胞，并在235 rcf离心5分钟
13. 重悬在适量的无菌FACS缓冲液中然后进行到
14. 在ARIA III上门控和分选CLP为谱系阴性，CD127 ⁺ Flt3 ⁺ Sca-1 ^int（参见图1的门控实例） ARIA II 使用70μm喷嘴。将CLPs直接排入1.5 ml的Eppendorf管中含有补充有20ng/ml IL-7的300μlILC培养基
15. 在分选后，在300μl的48孔板中平板7,500个CLPs /孔 cDMEM/IL-7（分类应当净大约15,000CLP /动物）对丝裂霉素C处理的OP9-DL1（见上文第一部分，C节）
16. 加入300μl新鲜的cDMEM培养基，补充有20ng/ml IL-7和 20ng/ml SCF每三天。在新鲜的OP9-DL1上进行更新浓度为每6天7,500个细胞/孔。添加细胞因子根据什么ILC子类型正在调查（即为ILC-2添加 ?20ng/ml IL-33）。
17. 可以使用分析细胞的ILC 以前报道的细胞表面标记和转录因子（见参考）早在CLP平板后6天。如果一个希望将人群极化为ILC2的命运，IL-33 以20ng/ml的浓度加入到培养基中（即，分离CLP）直接进入含有细胞因子的培养基中）（图1）
  
  图1.从野生型小鼠的骨髓分离常见淋巴祖细胞（CLPs）的门控策略。与轮廓区域相邻的数字表示每个门中的单元格百分比。 CLP具体定义为Lin ^- CD127 ⁺ Flt3 ⁺ Sca-1 ⁺。数据代表来自各自两只小鼠的细胞汇集的10个实验。

食谱

FACS缓冲液（500ml）
480ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）
15ml FBS（最终3％） 5ml 10％叠氮化钠溶液（在100ml去离子水中的10g NaN 3水溶液）
储存在4°C
无菌分选缓冲液（500 ml）
2.5克BSA（最终0.5％） 12.5 HEPES（最终25mM）
485 ml PBS
ILC媒体
DMEM高血糖
10％FBS
50μM2-巯基乙醇 1％青霉素 - 链霉素 1mM丙酮酸钠 1个非必需氨基酸
20mM HEPES（pH7.4） IL-7（20ng/ml） SCF（50ng/ml）
OP9-DL1媒体
Alpha-MEM
20％FBS
1％青霉素 - 链霉素

致谢

这项工作得到美国国家卫生研究院的支持。该方案从参考文献修改（Seehus等人，2015）。

参考文献

Seehus，C.R.，Aliahmad，P.，de la Torre，B.，Iliev，I.D.，Spurka，L.，Funari，V.A.and Kaye，J。（2015）。先天淋巴细胞的发育需要共同的先天淋巴细胞祖细胞的TOX依赖性产生。 a> Nat Immunol 16（6）：599-608
Wong，SH，Walker，JA，Jolin，HE，Drynan，LF，Hams，E.，Camelo，A.，Barlow，JL，Neill，DR，Panova，V.，Koch，U.，Radtke，，CS，Hwang，YY，Fallon，PG和McKenzie，AN（2012）。转录因子RORalpha对于黑素细胞发育至关重要。 Nat免疫 > 13（3）：229-236。