材料和试剂

微量离心管1.5-2 ml
CarboPac PA1分析柱（4×250mm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：035391）
CarboPac PA1保护柱（4×50mm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：043096）
玉米苗
4-硝基苯基α-L-阿拉伯呋喃糖苷（4NPA）（Sigma-Aldrich，目录号：N3641）
4-硝基苯酚（NP）（分光光度级）（Sigma-Aldrich，目录号：1048）
DL-二硫苏糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
快速启动 Bradford 1x Dye（Bio-Rad Laboratories，AbD Serotec ，目录号：5000205）
无水乙酸钠（NaOAc）（Sigma-Aldrich，目录号：W302406）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：306576）
L - （+） - 阿拉伯糖（Sigma-Aldrich，目录号：W325501）
NaN ₃
Na ₂ 3
NaOCl
冰醋酸
冰
MilliQ水（18MΩ-cm）
5％（w/w）NaOCl溶液（参见配方）
0.03％（w/w）NaN 3（参见配方）
50mM NaOAc缓冲液（pH6.0），其中在0.03％（w/w）NaN 3上具有3mM二硫苏糖醇（参见配方）
10 mM 4NPA（参见配方）
（参见配方）。
NP的校准解决方案（参见配方）
50％（w/w）NaOH溶液（参见配方）
15mM NaOH（HPAEC的缓冲液A）（参见Recipes）
1M NaOAc在0.1M NaOH（HPAEC的缓冲液B）（参见配方）中
阿拉伯糖的校准溶液（参见配方）

设备

分光光度计（所需波长为405nm）
恒温器（所需温度为27°C）
微量离心机（所需旋转速率为10,000×g ）
Thermoshaker（所需温度和旋转速率分别为37℃和600rpm）
注意：Thermoshaker应适合孵育微量离心管。
迷你离心机/涡流
具有0.1 mg可读性的分析天平
装备有电化学检测器ED40，梯度泵GP40和色谱炉LC30的离子色谱系统DX-500（Thermo Fisher Scientific，Dionex）
冰箱（所需温度为-20°C）
自动移液器（100-1,000,20-200和2-20μl）
砂浆和杵
塑料网格和适当尺寸的托盘
注意：网格单元格大约为1平方厘米或稍大。

软件

PeakNet软件（Thermo Fisher Scientific，Dionex，型号：5.21）

程序

实验的主要方案如图2所示。

图2.实验方案

将玉米种子（Zea mays L.）在5％（w/w）的 NaOCl洗涤10分钟，然后在水中洗涤两次。将种子放入塑料网格的细胞，其被安装在具有水的托盘中。植物在黑暗中在27℃的恒温箱中生长96小时。而任何部分的化学幼苗可用于测定，我们使用五个区 ?（分生组织，早期伸长，伸长，晚期伸长，后伸长）（图1）。推荐量每个样品中的植物材料为30-40mg。 1毫米的玉米根代表约1mg鲜重。因此，根块10 ?mm长度从三个或四个幼苗或1毫米长度的片段 30-40棵幼苗足够一次复制
30-40毫克新鲜植物材料用研钵和杵在冰上在1ml的水中均化 ?50mM NaOAc缓冲液（pH6.0）与3mM二硫苏糖醇混合以防止分子内和分子间二硫键形成和与 0.03％（w/w）NaN 3以限制细菌污染。均匀转移至微量离心管（1.5-2ml）。均匀已经准备好可以存储在冰箱（-20°C），而其他正在处理样本。
将1ml悬浮液离心10分钟 ?min，10,000×g/g。然后分离100μl上清液根据Bradford（1976）进一步估计蛋白质含量（步骤 ?9）和游离阿拉伯糖含量估计（步骤10）。上清可以储存在冰箱（-20°C）中。可以执行步骤9-10 后来。如果样品是阿拉伯糖和蛋白质含量不变冻结。
将沉淀重悬于剩余的900μl缓冲液中 ?解决方案。植物材料未从中分离上清液由于可能存在与壁相关可能不能被缓冲溶液萃取的阿拉伯呋喃糖苷酶。 ?将悬浮液分成两等份（每份450μl）转移到塑料管作为对照和每个的试验变体样品
将50μl在0.03％（w/w）NaN 3中的10mM 4NPA加入到试管中，并向对照管中加入50μl的0.03％（w/w）NaN 3。两者的 ?将变体在37℃下在600rpm下在热水瓶中温育 ?2小时。在此期间细胞壁阿拉伯呋喃糖苷酶（可溶性或 ?壁相关）在试管中从4NPA中移除阿拉伯糖残基分子产生黄色NP。对照管中的酶没有显色底物反应
通过反应停止反应向对照和向对照中加入500μl的1M Na 2 CO 3 SO 3。试管。溶液的着色变得更加显着此时由于pH增加（11.5）
样品在10,000×g离心10分钟。两种试验的光密度并在波上在分光光度计上测量对照上清液长度405nm。从试验平均值中减去对照平均值。的结果用于测定释放的NP的量根据校准。
进行校准测量 NP溶液，其浓度在0.0025mM至0.25mM的范围内（图3）。将500μl的1M Na 2 CO 3 3加入到500μl的每种NP中解决方案，因为它增强了着色
测定蛋白质含量。
1. 将490μl水加入10μl等分试样中来自每个样品的步骤3的上清液。 500μl的Bradford染料试剂也加入每个微量离心管中，然后使用混合涡流。
2. 5分钟后，每个样品在分光光度计上在595nm读数。
游离阿拉伯糖含量的测定。
1. 加入90μl水至10μl来自每个样品的步骤3的上清液的等分试样。
2. 25μl 得到的溶液直接注入HPAEC系统柱无需任何预处理。
3. 15mM NaOH（缓冲液A）和1M NaOAc的0.1M溶液 NaOH（缓冲液B）用作洗脱剂。柱温度保持在30℃，洗脱速率为1ml/min。梯度洗脱如下进行：0-20分钟-100％A; 20-21分钟线性梯度直到A/B比= 90:10（％）; 21-31分钟线性梯度 ?A/B比= 70:30（％）; 31-32分钟 - 线性梯度直到A/B比 ?0：100（％）; 32-42分钟-100％B; 42-43分钟，直到A/B比= 100:0（％）。将柱用100％A的洗脱液平衡30分钟。
4. 阿拉伯糖含量 ?通过使用PeakNet的相应峰的面积确定软件和阿拉伯糖标准的校准。
使用浓度范围为2-10μg/ml的溶液进行游离阿拉伯糖的校准

图3.不同硝基苯（NP）浓度的校准。 ?不混淆反应中NP物质的浓度和量体积（见表1）。

笔记

对于每个样品，实验应重复三到四次。
一个单位的阿拉伯呋喃糖苷酶活性对应于每分钟释放1μmolNP的酶量。样品之间的糖基水解酶活性的差异可以通过使用每mg总蛋白的酶活性单位来定义。阿拉伯呋喃糖苷酶活性计算的精确公式在图4中给出

图4.计算阿拉伯呋喃糖苷酶活性的公式。结果将以mg蛋白质含量的活性单位获得。
具有小修饰的描述方案可用于用合成的芳基糖苷测定任何其它糖基水解酶活性。初步实验可用于优化培养时间和植物材料量然而，仅通过发色底物水解的速率测量的酶活性可以保持潜在的并且可以在植物组织中不实现（Fry，2004）。芳基 - 糖苷水解与最终产物存在的证明相结合是更有说服力的。因此，步骤10和11包括在方案中。如果由于任何原因，您无法执行这些阶段，您可能只得出阿拉伯呋喃糖苷酶的潜在活性。

食谱

注意：下面给出的配方允许产生足以进行校准的溶液的量，以及四次重复的实验，每个复制品中有五个样品。

5％（w/w）的NaOCl溶液将25g NaOCl溶于475ml水中
0.03％（w/w）NaN 3·
将0.03g NaN 3溶于99.97ml水中
50mM NaOAc缓冲液（pH 6.0）中用3mM二硫苏糖醇在0.03％（w/w）NaN 3缓冲液将0.205g NaOAc和0.0231g DL-二硫苏糖醇溶解在40ml的0.03％（w/w）NaN 3中。通过加入冰醋酸将pH调节至6.0 通过加入0.03％（w/w）NaN 3
将体积调节至50ml
10 mM 4NPA
将0.0027g的4NPA溶解在0.03％（w/w）NaN 3中。
通过额外的0.03％（w/w）NaN 3/v/v将溶液的体积调节至1ml
1 M Na 2 CO 3 sub
在0.03％（w/w）NaN 3中溶解2.12g Na 2 CO 3。通过额外的0.03％（w/w）NaN 3/v/v将溶液的体积调节至20ml。

NP的校准解决方案
将0.0139g NP溶解在1ml的0.03％（w/w）NaN 3中以产生100mM NP溶液
将10μl的100mM NP溶液加入到990μl的0.03％（w/w）NaN 3中以产生1mM NP溶液。
根据下表准备9个NP浓度，放置500μl 的每个校准溶液加入到单独的管中并加入500μl的1M Na ₂ CO ₃
表1. NP解决方案准备

NP浓度，mM	反应中的NP物质的量体积（1ml），μmol	1mM NP溶液体积，μl	0.03％（w/w）NaN 3溶液体积，μl
0.25	0.125	250	750
0.1	0.05	100	900
0.05	0.025	50	950
0.025	0.0125	25	975
0.02	0.01	20	980
0.0125	0.00625	12.5	987.5
0.01	0.005	10	990
0.005	0.0025	5	995
0.0025	0.00125	2.5	997.5

50％（w/w）NaOH溶液 HPAEC缓冲液应使用NaOH模板溶液制备向5g NaOH中加入5ml去气的MilliQ水（18MΩ-cm）
15mM NaOH（HPAEC的缓冲液A）
在1000ml脱气的MilliQ水（18MΩ-cm）中加入780μl的50％NaOH
1M NaOAc的0.1M NaOH溶液（HPAEC的缓冲液B）
将82.05g NaOAc溶解在脱气的MilliQ水（18MΩ-cm）中通过加入脱气的MilliQ水（18MΩ-cm）将溶液的体积调节至1,000ml 加入5.23ml 50％NaOH至NaOAc溶液

阿拉伯糖的校准溶液
将0.001g阿拉伯糖溶解在1ml MilliQ水中以产生10mg/ml溶液
向900μlMilliQ水中加入100μl10 mg/ml阿拉伯糖溶液，得到1 mg/ml溶液
根据下表2制备5种阿拉伯糖溶液

表2.阿拉伯糖溶液制备

阿拉伯糖浓度，μg/ml	体积为1 mg/ml阿拉伯糖溶液，μl	MilliQ的体积，微博
2	2	998
3	3	997
5	5	995
8	8	992
10	10	990

致谢

该方案改编自以前发表的研究（Kozlova等人，2015）。这项工作部分支持俄罗斯基础研究基金会（项目## 14-04-01002和15-04-02560）。

参考文献

Bradford，M.M。（1976）。利用蛋白质染料结合原理的快速灵敏的微克量蛋白定量方法。 Anal Biochem 72：248-254。
Fry，S.C。（2004）。原代细胞壁代谢：跟踪生命中壁聚合物的职业生涯植物细胞。新植物 161：641-675
Kozlova，L.V.，Gorshkov，O.V.，Mokshina，N.E.and Gorshkova，T.A。（2015）。玉米中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的差异表达（ Zea mays L 。）根伸长。 241（5）：1159-1172。
Kozlova，L.V.，Snegireva A.V.和Gorshkova T.A.（2012）。混合连接葡聚糖在玉米根茎伸长不同阶段的分布和结构 Russ J Plant Phys 59：339-347。