材料和试剂

1ml注射器（Henke Sass-Wolff，目录号：5100.200V0）
针（16G，40mm）（Premier Healthcare& Hygiene，BD microlance，目录号：300637）
注意：根据玉米品种，可以使用不同厚度的针。
Falcon管（15ml）
微量离心管
点击iT EdU成像试剂盒（Life Technologies，目录号：10337）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM ，目录号：10337" br />
1. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine（EdU）
2. 小麦胚凝集素-Alexa Fluor 488（WGA AF 488）
3. 二甲基亚砜（DMSO）
4. 单击iT EdU反应缓冲液
5. 硫酸铜（CuSO 4）
6. 点击iT EdU缓冲添加剂
7. Hoechst 33342
磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10010023）
渗透试剂[例如在PBS（自制）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：R37602）中的0.5％Triton X-100]
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A8531）
100％乙醇
碘化丙锭（PI）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ，目录号：P1304MP）
注意：PI有毒，可能引起皮肤和呼吸道刺激。因此，在人身安全保护的情况下处理PI是很好的。
双蒸水
2％BSA的PBS（pH7.4）（参见配方）
碘化丙啶储备溶液（见配方）

设备

EdU标签室
注意：这些塑料室是定制的，以适合所需的样品）。显示该室的细节的图像如下所示（图1B）。作为标记室的替代方案，也可以使用50ml Falcon Tubes通过将受感染的叶浸入10μMEdU中来标记叶子。
共焦显微镜（例如，徕卡显微系统公司，型号：TCS-SP5）
真空泵
摇杆

软件

Leica成像软件（Leica）

程序

储备溶液的制备
1. 允许所有小瓶温热至室温。
2. 加入2ml DMSO或 ?水溶液至EdU（摩尔质量252.23g.mol ），以制备10mM EdU储备溶液。该股一般稳定一年储存于-20℃
3. 准备10x Click-iT EdU反应缓冲液加入3.6ml去离子水至iT EdU反应缓冲液。存储 ?在2-8℃
4. 通过加入70μlDMSO至Alexa Fluor 488 Azide制备Alexa Fluor叠氮化物溶液。在-20°C下混合储存。
5. 通过加入2ml去离子水制备10x Click-iT EdU缓冲液添加剂水点击iT EdU缓冲液添加剂混匀。储存于-20°C。
用EdU和固定标记细胞
注意：如前所述，Ustilago maydis感染在所需的玉米器官中进行（Redkar和Doehlemann，2016）。

对苗化样品
1. U。 maydis 幼苗或雄穗感染注射器接种方法通过注射接种物到所需的玉米器官（Redkar和Doehlemann，2016）
2. EdU标签是在要测量DNA合成的时间点进行。例如。 maydis 感染幼苗感染后4天（??dpi） ?选择时间点。在中。 maydis 感染幼苗第三第一感染症状出现的感染叶用于 EdU标记测定。
3. 将该叶与10μM温育5小时 EdU在小室（细节已经在前面提到）设计用于标记生理活性叶子，小心在积极定殖的感染标记以下的2cm区域是（图1A）。标记在温度下进行控制温室，以确保EdU的主动吸入叶细胞
  
  图1。 A.在玉米幼苗中标记EdU 检测感染叶中的S期细胞。 B. EdU标记的图像 ?带盖的室（左），室的盖除去插入幼苗样品（右）。 C.细胞分裂事件在被U感染的玉米幼苗中观察到。 maydis 野生型菌株 SG200在4 dpi。（左）EdU掺入细胞将导致在细胞分裂后同样标记的连续的子细胞由黄色箭头表示。（右）有丝分裂事件是很好的通过这种EdU标记法（比例尺=25μm）保存
4. 标记5小时后，注射器标记下面的2厘米区域叶分离并在100％（v/v）乙醇中固定。材料是收集在15ml Falcon管中。这个区域的玉米叶显示用最大定殖。 maydis ，因为它显示褪绿至小肿瘤症状4dpi。
对于流苏样品
1. U。毛发感染通过注射器接种进行方法通过递送1ml如前所述的孢子接种物（Walbot和Skibbe，2010）。
2. 对于穗状组织，EdU 标记测定在3dpi下进行，以捕获有丝分裂活性花药在它们转向减数分裂之前。
3. 在3 dpi的未成熟感染的雄穗（花药大小约1-1.5mm;图2）用1 ?ml的交付后20μMEdU
  
  图2. EdU处理时间点的未成熟玉米穗状花序
4. 注入的EdU通过之间的小空气空间进入小穗的外部器官并在标记上到达花药时间为5 h。
5. 在标记程序后，流苏是解剖出和约150个花药从流苏的不同部分以确保随机抽样的概率相等标记的花药，并在标记后5小时在100％（v/v）乙醇中固定。
标记的EdU的透化和染色
1. EdU染色程序如实施a所述进行（Kelliher和Walbot，2011）。对于幼苗样品，约。将1cm收集的组织固定在乙醇中使用。对于雄穗样品，约100个个体花药使用流苏的不同部分。完成标记过程在2ml微量离心管中用于苗和花药样品
2. 将固定的样品在乙醇中用新鲜的100％（v/v）乙醇，然后在PBS（pH 7.4）+ 2％（w/v）BSA中洗涤两次。更多用PBS缓冲液洗涤有助于完全去除来自幼苗样品的叶绿素
3. 然后是样品转移至透化溶液[PBS + 1％（v/v）Triton X-100] ?室温20分钟，摇动50-60转/分钟 ?（rpm）/min。该步骤也可以在具有该步骤的常规摇床上进行 rpm。 Triton处理导致活性核染色与EdU共染色相容。已知防止细胞收缩和快速渗透固定剂以允许更好的保存有丝分裂阶段（Kotogany等人，2010）。 a的图像表示细胞用EdU染色并显示良好保存的有丝分裂事件如图1B所示。
4. 样品在PBS + 2％（w/v）BSA，然后在室温下直接温育30分钟用于检测的EdU Click-IT鸡尾酒。 2.5ml EdU 鸡尾酒中加入以下组分（点击iT EdU反应缓冲液 - 2.2ml; CuSO 4-100μl; Alexa氟化叠氮化物 - 6μl;反应缓冲添加剂 - 250μl）。对于幼苗样品500μl 混合溶液用于每个透明微量离心管中其中花药这对应于100μl
5. 爱德华反应混合物还补充有20μg/ml碘化丙啶（PI）。这主要是对真菌菌丝和不分裂的染色宿主细胞核。
6. 然后孵育该EdU反应混合物在室温下50分钟，然后在250℃下真空渗透毫巴3次，每次5分钟，定期间隔5分钟与大气压力
7. 渗透后，样品在PBS（pH 7.4）+ 2％（w/v）BSA中洗涤两次，转移到新的PBS中（pH 7.4），并且可以在4℃下在黑暗中保存（直到几天）成像前。
显示EdU标记的叶和花药
所有共聚焦分析可在TCS SP5共聚焦激光扫描显微镜或类似装置上进行。用于激发和检测波长的共焦荧光分析的激光通道总结在表1中
Tabel 1.激光使用及激发和检测波长

检测
激发波长为
检测波纹
针孔使用

EdU耦合到WGA AF488
488 nm
490-540nm
?90μm

碘化丙啶
561 nm
570-640 nm
?90μm

由Leica TCS SP5共聚焦显微镜拍摄的所有图像由Leica Imaging软件处理和分析。

食谱

BSA（pH 7.4）中的牛血清白蛋白（BSA）（2％）将20g BSA加入1L PBS缓冲液（pH 7.4）中
碘化丙啶储液
10mg/ml在PBS中（在-20℃的黑暗中储存）。将该储备溶液直接加入到EdU反应混合物中，包括工作浓度的共染色。

致谢

我们的工作由马克斯普朗克学会，德意志交易所（DFG），德意志研究院（DAAD）和植物科学卓越集群（CEPLAS）资助。该协议改编自Kelliher和Walbot（2011）和Redkar等人（2015）。

参考文献

Kelliher，T.和Walbot，V。（2011）。五种细胞类型的玉蜀黍花药芽的出现和形成。 Dev Biol 350（1）：32-49。
Kotogany，E.，Dudits，D.，Horvath，G.V。和Ayaydin，F。（2010）。用于检测植物细胞和组织中S期细胞周期进展的快速而稳定的测定法，使用乙炔基脱氧尿苷。植物方法 6（1）：5.
Redkar，A.和Doehlemann，G.（2015）。 Ustilago maydis 在玉米中的毒力测定。 /em> 6（6）：e1760。
Redkar，A.，Hoser，R.，Schilling，L.，Zechmann，B.，Krzymowska，M.，Walbot，V。和Doehlemann，G。 Ustilago maydis的分泌效应蛋白指导玉米叶细胞形成肿瘤。植物细胞 27（4）：1332-1351。
Walbot，V.和Skibbe，D.S.（2010）。玉米宿主对 Ustilago maydis 肿瘤诱导的要求。 < em> Sex Plant Reprod 23（1）：1-13。