材料和试剂

带有卡扣帽的管，聚丙烯（1.5ml，11×38mm）Natural（Beckman Coulter，目录号：357448）
注意：可以使用任何超速离心管。确保管的体积不超过1.5到2毫升。否则，测定的处理是不可行的。
PIPES（Sigma-Aldrich，目录号：P6757）
（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
紫杉醇（Taxol）（Sigma-Aldrich，目录号：T7402）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：276855）
鸟苷5'-三磷酸钠盐水合物（GTP）（Sigma-Aldrich，目录号：G8877）
微球蛋白，牛，冻干（> 99％纯）（Cytoskeleton Inc.，目录号：TL238）或微管蛋白（> 99％纯）：猪脑（Cytoskeleton Inc.，目录号：TL240）
微管相关蛋白富集部分：牛脑（Cytoskeleton Inc.，目录号：MAPF）
NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶，1.0mm，15孔（Thermo Fisher Scientific，目录号：NP0323PK2）
注意：任何其他能够分离微管蛋白和目标蛋白的一维蛋白凝胶都可以工作。
Brilliant Blue G（Sigma-Aldrich，目录号：27815）
硫酸铝 - （14-18） - 水合物（Sigma-Aldrich，目录号：368458）
85％正磷酸（Sigma-Aldrich，目录号：345245）
十二烷基硫酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
Brinkley缓冲液1980（BRB80）（参见配方）
BRB80缓冲垫（见配方）
紫杉醇原料（见配方）
GTP股票（见配方）
微管坯料（见配方）
MAP级分股（见配方）
BSA股票（见配方）
胶体考马斯染色（参见配方）
Laemmli缓冲区（请参阅配方）

设备

Optima MAX-XP超速离心机（Beckman Coulter，目录号：393315）
TLA-55转子组件，固定角（45°角），铝（Beckman Coulter，目录号：366725）
注意：可以使用超速离心机和转子的任何组合。
BIO RAD ChemiDOC MP成像系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：1708280）注意：正常的文档扫描仪可以用来扫描蛋白质凝胶。扫描仪需要能够以未压缩的格式导出扫描。
SDS-PAGE系统分离1D中的蛋白质
涡流搅拌器

软件

ImageJ（斐济）
电子表格软件（例如 Microsoft Excel）
GraphPad Prism版本6.01（或更高版本）（GraphPad Software Inc）

程序

MT聚合
1. 在室温（RT）除霜一个紫杉醇等分试样（10μl的10mM紫杉醇 ?在DMSO中），并与990μlBRB80（BRB80-T）（最终紫杉酚浓度=100μM）。保持在室温。
2. 解冻一个微管蛋白等分试样（10μl的4mg/ml微管蛋白）在RT水浴中孵育直至解冻。立即将等分试样转移到冰上。
3. 加入1微升BRB80缓冲缓冲液 ?微管蛋白等分试样并在37℃下在水浴中孵育20分钟聚合MT。我们建议使用水浴均匀加热 ?样品
4. 孵育后加入100微升的BRB80-T到MT 稳定它们（最终微管蛋白浓度=约4μM）。保持在室温从现在开始。
MT结合测定
注意：该测定依赖于以下事实：MTs，因为它们的大分子量，当在100,000xg下纺丝时，沉淀。如果感兴趣的蛋白质与MT结合，则它也将在沉淀中发现。对于提供可靠结果的测定，需要测试蛋白在离心期间使用的条件下是稳定的（如果不是这样，则检查多种缓冲液）。我们建议您通过在缓冲溶液中离心分离蛋白质而不添加MT来测试蛋白质的稳定性。该测试确定在不存在MT的情况下在沉淀中发现蛋白质（或仅可忽略地）（也请参见图1）。通常，测定中的盐浓度应当保持最小，因为高盐浓度干扰MT结合。在我们的手中，MT和CC蛋白之间的相互作用在NaCl浓度高于约10μM时受到影响。 60 mM。
1. 准备如表1所述的7个反应。使用BSA作为阴性控制，因为它不绑定到MT。不同MT结合的混合物蛋白质（MAPF）用作阳性对照。浓度的测试蛋白应该足够高以至少添加5μg的蛋白质到测定。使用BRB80-T填充至50μl的体积。实用关于蛋白质表达的指南。大肠杆菌请参阅 Sivashanmugam等人（2009年）和Rosano和Ceccarelli（2014年）。
  
  表1.微管结合试验的实验设置
2. 在室温下孵育反应30分钟。
3. 解冻一份紫杉醇，加入990μlBRB80缓冲液（BRB80-CT）。通过上下吹吸混合轻轻混合，不引入空气气泡。如果引入气泡，则以10,000×g 旋转缓冲液30秒
4. 准备7超速离心管，并添加100微升的BRB80-CT到每个管。同样，避免向缓冲液中引入气泡。
5. 将反应如表1所示轻轻地放在顶部 BRB80-CT，不混合2种溶液。通过旋转反应通过缓冲缓冲区将未结合的MAP的分离微管增强。
6. 在100,000xg，23℃下离心30分钟。
7. 离心后，标记管的侧面远离 ?转子中心用笔。这是颗粒应该被发现（颗粒可能不可见）。
8. 注意离心后缓冲和反应之间的相分离不再可见。小心地从溶液的最顶部除去30微升。这是未结合蛋白的可溶性级分（参见图1）。不要丢弃它！
9. 小心地去除和丢弃其余的溶液使用 ?吸管。避免触摸以前标记的区域，以免打扰 MT颗粒。尝试不要留在管内的任何解决方案，因为这将是 ?稀释沉淀部分。颗粒将位于管侧 ?而不是在管的实际底部
10. 加入60μl1x Laemmli缓冲液（Laemmli，1970）直接到沉淀。混合并通过涡旋重悬
11. 向上清液部分中加入6μl5x Laemmli缓冲液。通过涡旋混合。
12. 通过SDS PAGE分离10μl的每个部分，并用凝胶染色 ?胶体考马斯染色（Dyballa和Metzger，2009）和图像凝胶。参见图1的代表性结果。
  
  图1。显示MT结合测定的代表性数据。测试蛋白是 CC1的带His标签的胞质结构域（CC1ΔC223）。 MAP分数（MAPF）用作阳性，BSA用作阴性对照，分别。与没有MT的控制相比（倒数第二泳道），CC1ΔC223在沉淀组分中显着富集存在MT（最后一泳道）。该图取自Endler等人（2015）。
通过凝胶光密度测定MT结合蛋白的解离常数（ K d ）
注意：对于该测定，假定蛋白质与MT的基本结合机制遵循一对一化学计量，即一个蛋白质分子结合一个α-/β-微管蛋白亚基。如果感兴趣的蛋白质的情况不是这样，则与微管蛋白结合的蛋白质的计算比率将最终超过1:1，并且所提出的方法在这种情况下是无效的。此外，测定的可靠性取决于MT在整个实验中是稳定的。如果你的蛋白质在MT上显示解聚或切断活性，这个测定也是不合适的（蛋白质越多，分别解聚或被切断的MT越多）。
1. 聚合MT（如A部分所述）。
2. 准备6种不同用相同的缓冲液条件稀释测试蛋白质，而不是超过30μl的体积。例如，对于总量的稀释体积V =10μl，使用xμl的测试蛋白质并加入10-xμl缓冲液以在所有稀释液中保持稳定的盐浓度。
  注意：如果超过20μl的体积，可以加入浓度为100μM的紫杉醇以防止MT解聚。
3. 复制具有最高蛋白质浓度的样品作为对照
4. 准备8个反应，如表2所述。最后的测定具有相同的条件（参见步骤C2）是重要的注意：为了准确估计K ，反应必须达到饱和，即蛋白质浓度的增加不会导致 MT结合的增加。首先，我们建议执行几个旋转 ?使用可变浓度的测试蛋白进行测定饱和点。确定饱和点后，即可 ?对于在饱和点以下收集足够的数据点是很重要的以精确拟合曲线并计算Kd。这是好的做法，重复实验（至少）3次以获取足够的数据分数，用于稳健分析。
  
  表2. 估计的实验设置
5. 在室温下孵育反应30分钟。
6. 在室温下解冻一份紫杉醇，加入990μlBRB80缓冲垫缓冲。通过上下吹吸混合轻轻混合，不引入空气气泡。如果引入气泡，则以10,000×g 旋转缓冲液30秒
7. 准备8超速离心管，并添加100微升BRB80-CT到每个管。同样，避免向缓冲液中引入气泡。
8. 将反应如表2所示温和地放置在顶部 BRB80-CT，不混合2种溶液。通过旋转反应通过缓冲缓冲液增强未结合的MAP的分离微管
9. 在100,000xg，23℃下离心30分钟。
10. 离心后，标记管的侧面远离 ?转子中心用笔。这是颗粒应该被发现（颗粒可能不可见）。
11. 注意离心后缓冲和反应之间的相分离不再可见。小心地从溶液的最顶部除去30微升。这是未结合蛋白的可溶性级分（参见图1）。不要丢弃它！
12. 小心地去除和丢弃其余的溶液使用 ?吸管。避免触摸以前标记的区域，以免打扰 MT颗粒。尝试不要留在管内的任何解决方案，因为这将是 ?稀释沉淀部分。颗粒将位于管侧 ?而不是在管的实际底部
13. 加入60μl1x Laemmli缓冲液（Laemmli，1970）直接到沉淀。混合并通过涡旋重悬。
14. 向上清液部分中加入6μl5x Laemmli缓冲液。通过涡旋混合。
15. 在SDS凝胶上按10所示的顺序加载10μl的每个组分图2A（上清液部分的代表性结果）。也加载a ?BSA标准品（5μg），以校正染色的差异在每个凝胶（图2A中最右侧的列）之间
16. 分开通过SDS PAGE分级，用胶态考马斯染色剂染色凝胶（Dyballa等人，2009）和图像/扫描他们。将图像文件保存在未压缩文件格式。

代表数据和分析

用斐济打开扫描的凝胶。
选择"矩形选择工具"，并在第一条车道周围绘制一个矩形。矩形的轮廓应该足够宽，以覆盖凝胶上的每个泳道。在键盘上按"1"。
在第一个选择中将出现"1"。使用鼠标单击并按住第一个选择内部，并将其拖动到第二个通道。在键盘上按"2"。
在第二个选择中将出现"2"。重复步骤3，直到您选择凝胶上的每个泳道与一个单独的矩形。一旦你把一个新的车道上的选择删除，不要忘记在键盘上按"2"。有关所有通道选择的代表性数据，请参见图2B
按键盘上的"3"。斐济将打开一个新窗口，其中显示每个选定车道的轮廓图（见图2C;为了节省空间，只显示了9条车道中的4条车道）。该图显示了泳道中每个条带的相对密度。泳道从顶部（泳道1; MT对照）至底部（泳道9; BSA标准）排列。
选择"直线工具"并将峰包围在背景信号的正上方（参见图2D）。确保包围峰，否则下一步将失败。
选择"魔杖工具"，然后单击每个峰。从左上角开始（从MT对照样品的MT带），并通过所有图，直到到达泳道9（BSA标准带）。将打开一个结果窗口，显示每个峰的面积（参见图2E）。
使用"Wand工具"分析所有峰后，点击"分析>凝胶>标签峰"。斐济将根据图中所有峰的总大小计算每个峰的大小百分比（见图2F）。

图2.显示上清液级分的代表性考马斯染色凝胶的分析的工作流程，以估计MT结合的蛋白质。A.考马斯染色的凝胶，显示8次独立的MT结合实验的上清液部分。将5μgBSA加载到凝胶上作为标准（最后一泳道）。在测定中使用CC1的His-标记的胞质结构域（CC1ΔC223）。显示了CC1ΔC223的浓度。微管蛋白，CC1ΔC223和BSA的分子量由箭头指示。 B到F.在斐济进行的操作的工作流程，用于在剖面图中测量蛋白质谱带的峰面积，如C部分，数据分析中所述。
将沉淀和上清液凝胶的数据复制到电子表格程序（例如Microsoft Excel）中。图3A和B显示了代表性数据来说明以下计算
计算每个峰相对于凝胶上BSA标准品的相对密度（见图3A）
如果在没有MT的情况下在沉淀中也发现测试蛋白质（测试蛋白质对照，参见表2，泳道8和图1A），我们推荐对其进行量化以用于后面的校正（称为"误差分数"，参见图3A，红色框）。
通过加入测试的每种蛋白质浓度的沉淀带和上清液条带的值来计算每个实验中存在的总蛋白质（参见图3C，编号1）。
通过误差分数校正总蛋白。
注意：这是一种简化的方法，因为它假设错误总是相同的，独立于测定中的蛋白质浓度（见图3C，数字1）。
使用图3C中突出显示的方程（数字2）计算相对于MT结合的蛋白质的百分比。如果你的蛋白质单独没有迁移到沉淀，你不必减去错误。
使用图3C（数字3）中突出显示的方程计算可溶性级分中测试蛋白质的浓度。在错误部分中发现的蛋白质应该是无功能的。因为这一点，我们没有在每个实验的可溶性级分的顶部添加误差分数。

图3.代表性数据，显示对从包含8个独立的MT结合实验的沉淀和上清液部分的2个代表性凝胶获得的数据集进行的计算，如图2A所示。A.计算相对峰面积相对于每种凝胶上的BSA标准。如果在没有MT的情况下在沉淀中也发现感兴趣的蛋白质，我们建议通过在实验中将蛋白质的总量标准化沉淀中存在的蛋白质的量来计算误差分数（参见红色框）。 B.计算蛋白质总量，与MT结合的蛋白质的比例和溶液中蛋白质的量。 C.用于计算B中的值的方程式.A和B中的小方框表示在方程式中使用的示例性值。颜色编码：公式1-绿色，公式2-橙色，公式3-蓝色
打开GraphPad Prism并创建一个新的XY项目，并选择"Binding>饱和结合，特异性结合"模式
将"％结合蛋白质与微管"的值复制到Y柱中（参见图4A）。
将"溶液中的蛋白质（μM）"的值复制到X列中（参见图4A）
按"分析"（图4A中突出显示）。
选择"非线性回归（曲线拟合）"。
将打开参数选项。选择"绑定">饱和"，"一个站点>特异性结合"。
您将在"结果"列表中找到 K _d和其他统计数据（R2，置信区间等） "标签。
在"图表"选项卡中，可以找到一个显示拟合曲线和数据点的图表。图4B示出了在该协议中使用的代表性数据的图表

图4.在GraphPad Prism中执行的分析 A. GraphPad Prism的分析窗口显示如图3B中计算的数据。 "分析"按钮突出显示。 B.在将饱和结合曲线（参见框）拟合到图3B和图4A所示的数据之后获得的代表性曲线

笔记

如果测试蛋白在BRB80缓冲液中不稳定，可以交换 BRB80到其他缓冲液只要紫杉醇保留在缓冲液中即可稳定MT。代表性实验的实例如图1所示 ?图5.使用与之前相同的测试蛋白，但我们用50mM TRIS-HCl（pH 6.9），100μM紫杉醇代替BRB80-T以稳定 ?聚合后的MT（参见A部分，步骤4）。在这些条件下，在不存在时在沉淀级分中没有检测到蛋白质 MTs（泳道1）。另一方面，微管蛋白的丰度增加上清液是可见的，但这通常不影响只要发现微管蛋白的量在测定的结果上清液在所有实验中是恒定的。
记住，高盐浓度（> 50mM，参见上文）可以干扰测试蛋白与MT的结合。高钙浓度（> 1mM）（O'Brien等人，1997）显示解聚MT。缓冲液的pH应该在大约1的生理范围内。 6.0-8.5。
如果测试蛋白具有与微管蛋白相同的分子量（约50μM） ?kDa），因此它们不能通过SDS-PAGE分离，有可能在蛋白质印迹中特异性检测蛋白质和微管蛋白。在这里病例，我们建议使用针对纯化标签的抗体 ?测试蛋白和针对α-或β-微管蛋白的特异性抗体。数据这里显示的分析也用于通过Western获得的膜印迹

图5.显示MT结合测定的代表性数据。测试蛋白是CC1的His-标记的胞质结构域（CC1ΔC223）。与图1A相比，将BRB80-T更换为50mM TRIS-HCl（pH 6.9），100μM紫杉醇。注意，在不存在MT的情况下，在沉淀中没有发现蛋白质，因为增强的蛋白质稳定性。垂直黑线表示两种不同凝胶之间的间距。

食谱

Brinkley缓冲液1980（BRB80）
80mM PIPES，用KOH调节至pH6.0 2mM MgCl 2/
0.5mM EGTA
BRB80缓冲缓冲器
80mM PIPES，用KOH调节至pH6.0 1mM MgCl 2
1 mM EGTA
60％甘油
紫杉醇股
10mM紫杉醇的DMSO溶液分成10μl等分
储存于-20°C
GTP股票
在BRB80中为20mM
分成12.5μl等分
储存于-20°C
微管蛋白股票
保持冰上（！）
将247.5μl冰冷的BRB80与12.5μlGTP原液（=250μlBRB80 + 1mM GTP）混合
用250μl冰冷的BRB80 + 1mM GTP（浓度= 4mg/ml）重构1mg微管蛋白。
轻轻摇动管直到微管蛋白溶解
在冰上分成10μl等份
在液氮中快速冷冻
储存于-80°C
MAP分数股
在100μl冰冷的Milli-Q水（最终MAP浓度为1mg/ml）中重构100μgMAP级分
在冰上分成11μl等分试样
在液氮中快速冷冻
储存于-80°C
BSA股票
在冰冷的BRB80中制备浓度为2.5mg/ml的BSA溶液分成5微升等分在冰上
在液氮中快速冷冻
储存于-80°C
胶体考马斯染色
请按照Dyballa和Metzger（2009）的规程
Laemmli缓冲区
60 mM Tris-HCl（pH 6.8）
2％SDS
10％甘油 5％β-巯基乙醇 0.01％溴酚蓝

致谢

该方案由Goode等人（1994），Gustke等人（1994）和来自"Microtubule Binding Protein Spin-down Assay Kit"的数据表改编和修改，由Cytoskeleton，Inc.出售（ http://www.cytoskeleton.com/pdf-存储/datasheets/bk029.pdf ）。
CK通过马克斯普朗克学会的IMPRS奖学金和墨尔本大学的墨尔本国际研究奖学金资助。 SP由UMA的R @ MAP教授担任。部分研究通过DFG授予PE1642/6-1和ARC授权DP150103495资助。

参考文献

Dyballa，N.和Metzger，S。（2009）。快速和灵敏的胶体考马斯G-250染色，用于聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。 J Vis Exp （30）。
Endler，A.，Kesten，C.，Schneider，R.，Zhang，Y.，Ivakov，A.，Froehlich，A.，Funke，N.and Persson，盐胁迫过程中持续纤维素合成的机制单元 162（6）：1353-1364。
Goode，B.L。和Feinstein，S.C。（1994）。在发育调节的tau重复区间鉴定新的微管结合和装配结构域。/a> J Cell Biol 124（5）：769-782。
Gustke，N.，Trinczek，B.，Biernat，J.，Mandelkow，E.M.and Mandelkow，E。（1994）。 tau蛋白的结构域和与微管的相互作用生物化学 33（32）：9511-9522。
Laemmli，U.K。（1970）。在噬菌体T4头部装配过程中切割结构蛋白。自然 227（5259）：680-685
Mandelkow，E。和Mandelkow，E.M。（1995）。微管和微管相关蛋白。 Curr Opin Cell Biol 7（1）：72-81。
O'Brien，E.T.，Salmon，E.D.and Erickson，H.P。（1997）。钙如何导致微管解聚细胞运动和细胞骨架 36（2 ）：125-135。
Rosano，G.L.和Ceccarelli，E.A。（2014）。大肠杆菌中的重组蛋白表达：：进展和挑战。 Front Microbiol 5：172
Schindelin，J.，Arganda-Carreras，I.，Frize，E.，Kaynig，V.，Longair，M.，Pietzsch，T.，Preibisch，S.，Rueden，C.，Saalfeld，S.，Schmid，B 。，Tinevez，JY，White，DJ，Hartenstein，V.，Eliceiri，K.，Tomancak，P.and Cardona，A。（2012）。斐济：用于生物图像分析的开源平台。方法 9（7）：676-682。
Schindelin，J.，Rueden，C.T.，Hiner，M.C.和Eliceiri，K.W。（2015）。 ImageJ生态系统：用于生物医学图像分析的开放平台 Mol Reprod Dev 82（7-8）：518-529。
Sivashanmugam，A.，Murray，V.，Cui，C.，Zhang，Y.，Wang，J.and Li，Q。（2009）。使用大肠杆菌生产非常高产量的重组蛋白的实用方案。 Protein Sci 18（5）：936-948。