材料和试剂

分枝杆菌培养物（50至100ml）
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
EDTA（HiMedia Laboratories，目录号：MB011）
注意：在双蒸水中制备0.5 M溶液（pH 8）。
液氮
蛋白酶K（HiMedia Laboratories，目录号：RM2957）注意：在TE缓冲液（pH 8）中制备10 mg/ml的储备溶液。
SDS（??Bio Basic Canada，目录号：SB0485）
注意：溶解于双蒸水中制备10％的溶液。
溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：L6876）注意：在双蒸水中制备100 mg/ml的储备溶液。
苯酚（Sigma-Aldrich，目录号：P4557）注意：用Tris-HCl（pH 8）平衡。
氯仿（HiMedia Laboratories，目录号：AS041）
异戊醇（HiMedia Laboratories，目录号：MB091）
2-丙醇（HiMedia Laboratories，目录号：MB063）
乙醇，Pure（Sigma-Aldrich，目录号：459844）
无核酸酶水（HiMedia Laboratories，目录号：TCL016）
TE缓冲区（参见配方）
PCI混合（见配方）

设备

水浴
离心机
杵和臼

程序

通过在2,000×g离心20-40ml对数期培养物（O.D. 600≈0.8）10分钟，室温下收获分枝杆菌。小心丢弃培养基并加入10ml TE（室温）缓冲液沉淀。用移液管轻轻混匀。
注意：如果从致病性分枝杆菌如结核分枝杆菌中分离DNA，则必须在BSL-3设施中进行步骤1和2。
孵育分枝杆菌悬浮液在80℃水浴1小时。该步骤将有利于分枝杆菌细胞壁的松动，并且还将灭活病原分枝杆菌。
将悬浮液的温度降至?30℃，并向其中加入20μl的100mg/ml溶菌酶溶液（终浓度为2mg/ml）。在37℃下在水浴中孵育悬浮液6小时至过夜注意：在快速生长的分枝杆菌如耻垢分枝杆菌（耻垢分枝杆菌）的情况下，直接进行步骤7.然而，如果要从缓慢生长的物种中分离DNA，则遵循涉及裂解的步骤4-6的细胞。由于细胞的增强的破坏，这将显着提高产量。
通过在2,000xg下离心10分钟，室温下并且仔细丢弃上清液，使下部杆菌沉淀。
在液氮中快速冷冻沉淀物并立即转移到研钵中。使用杵，粉碎细菌，同时重复地向其中加入液体N 2（?20ml）。
加入10ml TE缓冲液到砂浆中，小心使分枝杆菌悬浮。将此悬浮液转移到50ml聚丙烯管中
加入1ml的10％SDS溶液（终浓度?1％）和20μl的10mg/ml蛋白酶K溶液（终浓度20μg/ml）。在60°C的热水浴中孵育2至4小时
向管中加入等体积的PCI混合物，通过轻轻颠倒管混合内容物5-10分钟
在4℃下以12,000xg离心悬浮液10分钟。小心地将上层水相转移到新的50ml管中
重复步骤6到8以获得更高纯度的DNA
在步骤10中得到的每ml水相中加入100μl3M乙酸钠溶液。通过倒置管轻轻混合。
向管中加入等体积的异丙醇。轻轻混合内容，保持不受干扰5-10分钟。沉淀的DNA的白色线状结构将在悬浮液中看到（图1）
离心管在12,000×g下10分钟，4℃。小心丢弃液体。
通过加入10ml的75％乙醇洗涤DNA沉淀。在4℃下以12,000xg离心10分钟。
吸出液体，不要打扰沉淀。保持管开放至空气干燥颗粒。不要过度干燥颗粒，因为过干的DNA将难以溶解。
将颗粒溶解在分子生物学级水中，通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计分析DNA的纯度和完整性。

图1.沉淀的分枝杆菌DNA（如步骤12后所示）

食谱

TE缓冲区
50 mM Tris
5 mM EDTA
使用HCl将pH调节至8
PCI混合物
Tris-饱和苯酚至pH 8
混合苯酚：氯仿：异戊醇，体积比为25:24:1，体积比为

参考文献

Amaro，A.，Duarte，E.，Amado，A.，Ferronha，H。和Botelho，A。（2008）。比较牛分枝杆菌，分枝杆菌的三种DNA提取方法肺结核和分枝杆菌 avium subsp。 avium。 Lett Appl Microbiol 47（1）：8-11。
Kumar，P.，John，V.，Marathe，S.，Das，G.and Bhaskar，S。（2015）。 Mycobacterium indicus pranii 诱导树突状细胞活化，存活和Th1/Th17极化电位以TLR依赖性方式。 Leukoc Biol 97（3）：511-520。