材料和试剂

RPMI-1640培养基（HiMedia Laboratories，目录号：AT028）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（HiMedia Laboratories，目录号：TS1006）
热灭活的胎牛血清（Biological industries，目录号：04-121-1A）
抗生素 - 抗真菌剂（青霉素 - 链霉素）溶液，100x（HiMedia Laboratories，目录号：A002A）
圆底96孔细胞培养板（Corning，目录号：3799）
树突状细胞（通过在重组GM-CSF存在下培养小鼠骨髓细胞得到）（PeproTech，目录号：315-03）
使用CD4 T细胞富集试剂盒和CD8 T细胞富集试剂盒（BD，USA）从同种异体小鼠品系（从Balb/c小鼠的脾中分离）的未接触的CD4 +和CD8 +目录号：558131和558471）
荧光染料偶联的FITC抗小鼠CD3，PE抗小鼠CD4和PE抗小鼠CD8抗体（BD Pharmingen，目录号：555274,553730和553032）
刀豆蛋白A（Sigma-Aldrich，目录号：C5275）
3 H-胸苷（BARC）
台盼蓝（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
RPMI-10（见配方）

设备

血细胞计数器
加湿CO 2培养箱
层流气流生物安全柜
离心机
伽玛辐照器
显微镜
流式细胞仪

程序

通过温和移液从板中收获小鼠骨髓来源的树突细胞（BMDC），用PBS洗涤，并制备1.0×10 5，2.0×10 5，和在RPMI-10培养基中的4.0×10 5个细胞/ml。
（BMDCs是通过在GM-CSF存在下培养小鼠骨髓细胞而得到的）简单地说，在6孔板的每个孔中加入4×10 6个骨髓细胞的RPMI-10培养基20ng/ml GM-CSF，在第3天和第5天除去培养基以及非粘附细胞，向每孔中加入新鲜的4.0ml GM-CSF补充培养基，在第7天通过轻轻吸取收集未成熟DC，在RPMI-10培养基中洗涤，细胞可用于随后的实验。根据该方案得到的DC的纯度为?85％，这些细胞可以直接用于allo-MLR或可以进一步纯化）。
为了分析DC诱导T细胞增殖的能力，将50μl的DC悬浮液（相当于0.5×10 4个，1.0×10 4个和2.0×10 8个）在圆底板中每孔一式三份重复培养（有必要铺板数量增加的DC以实现刺激细胞与响应细胞的增加比例，建议不要将DC添加到板的外孔中，因为培养基倾向于以更高的速率从这些孔中蒸发，而是，这些孔可以用高压灭菌的蒸馏水填充）
为了分析DCs诱导T细胞极化的能力，同样地每孔加入50μl2.0×10 5个细胞/ml DC悬浮液（= 1.0×10 4个细胞）在一个圆底板上一式三份
添加所需的刺激，如LPS或热灭活分枝杆菌到平板DCs，并调整每孔的总内容物的最终体积为100微升。
[在RPMI-10培养基中稀释LPS或分枝杆菌悬浮液至所需浓度的储备溶液。 LPS可以以0.1至1.0μg/ml的浓度使用，而热灭活细菌（通过高压灭菌制备）可以优选以5至10的感染复数（MOI）使用。
将板在加湿的CO 2培养箱中保持24小时
第二天，使用阴性选择试剂盒如制造商所建议的从初始同种异体小鼠的脾中分离CD4 +和CD8 + T淋巴细胞。使用抗小鼠CD3/CD4和CD3/CD8抗体通过流式细胞术确定淋巴细胞的纯度。
注意：如果DC源自C57BL/6小鼠，则可以从Balb/c小鼠制备淋巴细胞。
在γ-照射室中用γ-射线照射DC（照射剂量，25Gy）。照射将防止DC的增殖，否则可能会导致错误的结果
将淋巴细胞的浓度调节至1.0×10 6个细胞/ml。加入100微升的细胞悬浮液照射DCs
通过用伴刀豆球蛋白A（终浓度为5μg/ml）刺激CD4 + T细胞和CD8 + sup + T细胞来设置阳性对照。
将板在37℃下在加湿的CO 2培养箱中保持。
72小时后，在用T细胞增殖测定设置的板的每个孔中加入1.0μCi3 H-胸苷。保持板回到CO 2培养箱。
18小时后，将板转移至-20°C。平板可以立即或第二天解冻。
收获细胞在滤纸上，并使用自动细胞收获器清洗。
使用β闪烁计数器测量滤纸上的 3 H-胸苷水平
在96小时后，用T细胞极化测定法收集来自培养板的培养物上清液。将上清液存储在-80℃或立即通过ELISA分析T H H 1，T H H 2，T H H 17标志性细胞因子。 />

食谱

RPMI-10
补充有10％热灭活的FBS和1％抗生素 - 抗真菌溶液的RPMI-1640基础培养基

参考文献

Kumar，P.，John，V.，Marathe，S.，Das，G.and Bhaskar，S。（2015）。 Mycobacterium indicus pranii 诱导树突状细胞活化，存活和Th1/Th17极化电位以TLR依赖性方式。 Leukoc Biol 97（3）：511-520。
Muul，L.M.，Silvin，C.，James，S.P.and Candotti，F。（2008）。测量培养淋巴细胞的增殖反应 Curr Protoc Immunol 第7章：单位7 10 11-17 10 24.