材料和试剂

流动室：μ-Slide I 0.4 Luer（ibidi，目录号：80176）

图1.流动室：μ-Slide I 0.4 Luer（修改了来自 www.ibidi.com ）
μ-Slides串行连接器（ibidi，目录号：10830）
注射器（10ml，30ml）
硅胶管（0.8mm ID）（ibidi，目录号：10841）
50ml具有管线连接的管（SARSTEDT AG& Co，目录号：60.596）
Y管配件（ibidi，目录号：10828）
重量（SP Scienceware，Bel Art，目录号：F183240000）
软管夹（ibidi，目录号：10821）
人微血管内皮细胞（HMVEC）（Lonza，目录号：CC2543）
癌细胞
细胞系或原发性癌细胞[例如人乳腺癌细胞系MDA-MB-231（ATCC，目录号：CRM-HTB-26）]
内皮基础培养基-2（Lonza，目录号：CC-3156）
EGM SingleQuot Kit（Lonza，目录号：CC-4133）
补充有1％胎牛血清（FBS）的Dulbecco's Modification of Eagle's Medium（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Mediatech，Cellgro ，目录号：13-013）
热灭活胎牛血清（FBS）（Life Technologies，目录号：10082-1??47）
注意：目前，是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：10082-1??47。
Glutamax（Life Technologies，目录号：35050）
注意：目前，是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：35050" />
抗生素 - 抗真菌剂（Life Technologies，目录号：15240）
注意：目前，是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：15240" />
胶原I，鼠尾（Life technologies，目录号：A1048301）
注意：目前，"赛默飞世尔科技，Gibco ^TM ，目录号：A1048301" />
来自人血浆的纤连蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：F0895）
用于HMVEC的细胞培养基（参见配方）
癌细胞的细胞培养基（参见配方）

设备

玻璃烧杯（1000ml）
搅拌棒
37℃，5％CO 2细胞培养箱（NuAire，型号：In-VitroCell ES NU-5800）中培养。
细胞培养离心机（Eppendorf，型号：5702）
带相机的倒置显微镜（尼康，型号：Eclipse TS100）
相机（McCrone，型号：MicroPublisher 3.3 RTV）
KDS Legato ^TM 200注射泵（KD Scientific）

图2. KDS Legato ^TM 200注射泵（http://www.kdscientific.com/products/pumps/Legato200.asp ）
Ibidi加热系统[Ibidi Temperature Controller© ibidimodel（ibidi，model：Version 3.3）]

图3. Ibidi供热系统（ http://ibidi.com/xtproducts/en/Instruments-Accessories/Heating-Incubation-Systems/ibidi-Heating-System-Universal-Fit ）
磁力搅拌（Thermo Fisher Scientific，目录号：200-48SH）
温度计（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-201-695）
Level（Stanley Black& Decker，目录号：43-511）

软件

Q捕获pro 7.0（Qimaging）

程序

在流动室中生长HMVEC单层（μ-Slide I 0.4 Luer）
1. 稀释胶原（250μg/ml）和纤维连接蛋白（75μg/ml），灭菌 PBS。用胶原和纤连蛋白混合物填充流动室溶液中，并在RT下在培养罩中孵育1-3小时（例如100μl 胶原和纤连蛋白混合物溶液用于μ-Slide I 0.4 Luer）。
2. 要清洗流动室，请将无菌水加入一个通道末端并从另一侧通道取出相同的体积 ?结束。对于μ-Slide I，使用5倍体积的流动室（例如500μl） 0.4 Luer）。
3. 填充室100μl的新鲜培养基。
4. 在100μlHMVEC细胞中浸泡HMVEC细胞（1×10 5个HMVEC细胞）培养基）注射到涂布有胶原/纤连蛋白的流动室中从相对侧通道末端除去预填充的培养基。做在输注HMVEC细胞之前不从步骤3除去培养基避免气泡的形成。填充两个鲁尔油藏（图1）。孵育培养物直至HMVEC细胞生长至 100％汇合，约2-3天。关键是使用100％汇合的内皮单层以避免癌细胞被卡住在内皮细胞之间。防止介质干燥和保持无菌条件下，放上盖子（提供流动室制造商）在两个鲁尔水库。更换培养基在流动室内，首先，从两个鲁尔去除旧介质水库不在通道内。然后，加入新鲜培养基一个通道端的流动室和去除相同体积的旧介质从相对侧通道端。重新填充两个鲁尔水库的流动室（图2）。
  
  图4.流动中的细胞接种 chamber - 修改自Ibid Application Note 3 （ http://ibidi.com/） fileadmin/support/application_notes/AN03_Growing_cells.pdf ）
  
  图5.更改流动室中的介质。（ http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN03_Growing_cells。 pdf ）
用泵装配流动室，进行流动粘附试验

图6.流动粘附测定的整体设置图
1. 装配水库，打开热板，将水加热至37°C
  
  图7.装配油藏（步骤B1）
2. 将注射泵旁边的倒置显微镜，并在37℃开启ibidi加热系统
3. 填充容器A和B与组织培养基和洗线 ?通过用含有1％FBS的DMEM刺入，确保没有空气气泡。用软管夹关闭两个管。
4. 准备单细胞悬浮的癌细胞（MDA-MB-231细胞：1×10 5个细胞/ml，在10ml 的含有1％FBS的DMEM），并加入到磁力搅拌的储存器A中酒吧。（细胞浓度可能不同）。
  
  图8.将细胞添加到水库A中，对应于步骤B4
5. 将具有HMVEC单层的流动室置于ibidi加热系统上。
  
  图9.使用培养基通过连接到水库B的线进行线洗的过程
6. 释放储存器B的软管夹，并从中取出培养基这个水库。将管道的串行连接器端连接到鲁尔连接器（IN）。避免让任何气泡进入通道。
  
  图10.将管线连接到注射泵（步骤B6）
7. 一旦通道充满培养基，将注射器泵的串行连接器连接到Luer连接器（OUT）
8. 以恒定流速设置注射器取出泵。的流速将根据每种类型的剪切应力计算而变化 ?的流动室。（例如，对于使用μ-滑动I的剪切应力为1达因/厘米<2> 0.4 Luer，流速设定为0.76ml/min。了解更多信息关于不同类型流动室中的流速和剪切应力，请检查 http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress中的应用笔记11。 pdf ）。 ?应测试不同的剪切应力。（*见下面的注释程序）
  
  图11.平衡腔室和水库的高度
9. 为了避免基于重力的输注，使用水平仪来确保储存器A的底部和流动处于相同的高度。
  
  图12.开始流动粘附测定
10. 运行注射器泵并检查下面通道内的流体流量显微镜。确保路径或通道中没有气泡。
11. 打开储液罐A的软管夹，并关闭软管夹输注癌细胞（MDA-MB-231细胞：1×10 5个细胞/ml 10ml含1％FBS的DMEM）中5分钟
12. 关闭水库A，打开B，用培养基冲洗管道。
13. 计数粘附在HUMVEC下的癌细胞显微镜或拍照（至少5个字段）使用Q捕获pro 7.0 并计数粘附的癌细胞。图13中的红色箭头显示 MDA-MB-231细胞在1dyn/cm 2下粘附于人内皮细胞5天 min在37℃
  
  图13.癌细胞粘附至单层的图像的内皮细胞。红色箭头表示癌细胞粘附内皮细胞。

笔记

每个细胞系的粘附是不同的。实验条件可能需要基于感兴趣的细胞进行优化。
测试不同流速是值得的。我们通常使用1-5 dyn/cm ²。
重要的是内皮细胞完全融合，在细胞之间没有空间。

食谱

HMVEC的细胞培养基
补充有2％FBS的内皮基础培养基-2 EGM SingleQuot套件包含：
表皮生长因子（EGF）10ng/ml
氢化可的松1μg/ml
庆大霉素30μg/ml
两性霉素B（GA-1000）15ng/ml
用于癌细胞的细胞培养基（例如MDA-MB-231）
补充有10％胎牛血清（FBS）的Eagle培养基（DMEM）的Dulbecco's修饰
1％glutamax
1％抗生素 - 抗真菌剂

致谢

这项工作由国防部（W81XWH-11-1-0238到T.T），国家卫生研究院（1R01CA160271-01A1到T.T），美国癌症协会（IRG-08-060-04 ）和宾夕法尼亚州乳腺癌联盟（T.T）。图像由ibidi USA，Inc.，Madison WI（ibidi.com）共享。

参考文献

Kang，SA，Hasan，N.，Mann，AP，Zheng，W.，Zhao，L.，Morris，L.，Zhu，W.，Zhao，YD，Suh，KS，Dooley，WC，Volk， Gorenstein，DG，Cristofanilli，M.，Rui，H。和Tanaka，T。（2015）。阻断前转移间隙处的粘连级联，用于预防乳腺癌转移。 Mol Ther 23（6）：1044-1054。