第一部分拟南芥间期细胞核的流式细胞分选

材料和试剂

22x22 mm高精度盖玻片（170±5μm，编号1.5H）（Marienfeld-Superior）橡胶胶泥（Marabu Australia，目录号：290110000）
将具有35μm细胞过滤帽（BD Bioscienes，目录号：352235）的5ml聚苯乙烯圆底管或可选地，与一次性过滤器CellTrics，30或5的组合的5ml聚苯乙烯圆底管（BD Biosciences，目录号：352063） 50μm（Sysmex-Partec，目录号：04-0042-2316或04-0042-2317）
注意：目前，"Corning，Falcon ^?目录号：352235"和"Corning，Falcon ^?，目录号：352063" >
0.22μm过滤器
A。 thaliana 玫瑰花叶
校准珠[SpheroTM彩虹校准颗粒（8个峰）]（BD Biosciences，目录号：559123）
Accudrop Beads（BD FACS ^{Accudrop Beads）（BD Biosciences，目录号：345249）}
甲醛溶液37％（Carl Roth GmbH + Co，目录号：7398.1）
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：D-1306）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：D-1306"。
Milli-Q水
NaCl
2
NaH 2 PO 4 sub
Tris
Na 2 EDTA
Spermin
KCl
Triton X-100
NaOH
β-巯基乙醇
MgCl 2
蔗糖
吐温20
HCl
BD FACSFlow鞘液（BD Biosciences，目录号：342003）或者1×PBS（参见Recipes）
甲醛固定剂（参见配方）
500 ml Tris缓冲液（见配方）
200ml裂解缓冲液LB01（Dolezel等人，1989）（参见Recipes）
100μg/ml DAPI储备溶液（见配方）
25ml蔗糖缓冲液（见Recipes）

设备

FACSAria IIu（BD Biosciences）

软件

FACSDiva软件

程序

核隔离
1. 收获2-3周龄的4至6周龄的植物的玫瑰花叶。 thaliana 转换成蒸馏水（或去离子水）
2. 将植物组织转移到甲醛中固定固定剂并在冰上在小玻璃烧杯中孵育20分钟使用干燥器抽真空
3. 在滤纸上短暂干燥植物材料。
4. 在冰上用新的玻璃烧杯在Tris-缓冲液中洗涤2x 10分钟，并干燥 ?关闭植物材料不久在滤纸之间的洗涤步骤。
5. 转移植物组织在预冷却的培养皿中，添加大约250微升的LB01裂解缓冲液，并用锋利的刀片切割，直到得到精细的悬浮液
6. 添加额外的250-750微升（取决于关于使用的植物组织的量）的LB01裂解缓冲液并过滤悬浮液通过30-50μm网（使用带有细胞的管）过滤器帽或其他一次性过滤器）装入5ml圆底瓶中聚苯乙烯管并将其存储在冰上。可以使用该悬浮液直接制备适于免疫染色的核制剂实验（继续程序C'制备盖玻片）或用于荧光激活细胞分选（FACS）。后一种变体允许分离核根据不同的倍性水平并导致制备的高纯度，保证最低的背景
7. 通过添加DAPI储备溶液至1-2μg/ml的最终浓度并在冰上储存10分钟来染色悬浮液。
使用FACSAria细胞分选仪对核进行分选
1. 打开计算机，细胞仪和蓝色（488 nm）和紫色（405nm）或（近）UV（375nm）激光并等待30分钟他们热身。启动FACSDiva软件，检查级别流式细胞仪窗口和再填充分选缓冲液（BD FACSFlow 或1x PBS），如果需要，清空废物。执行流体启动，插入一个70μm的喷嘴并打开气流。控制是否正确选择排序设置（'排序' - '排序设置' - '70微米'）。打开 '断点'窗口中的'甜点'。
2. 运行校准珠控制分流器的性能。如果不显示8个峰 ?在FITC和DAPI的相应对数标度直方图中，清洁流 ?细胞根据FACSAria用户指南或的说明操作员
3. 运行Accudrop Beads并确定最佳液滴延迟 ?使用FACSAria的"自动丢弃延迟"功能 FACSAria用户指南。
4. 运行核心示例，设置触发器 DAPI荧光，并选择一个适当的阈值水平，允许您 ?在侧散射（SSC）面积的点图上显示信号尺度）对DAPI荧光面积（对数尺度）。调整电压光电倍增管为DAPI荧光实现显示 ?所有倍性水平群体（图1A）
5. 定义一个门核子群体并选择这将显示在直方图中 ?DAPI荧光面积。定义倍性水平的分类区域 ?兴趣（图1B）。
6. 打开"排序布局"窗口，选择收集装置'4 Tube'，精密模式'纯度'并定义排序位置。将空的Eppendorf管插入收集装置持有人
7. 排序所需的核数（10,000到50,000; 取决于个体倍性水平的可用性和所需数量的盖玻片）装入收集管并储存之后在冰上
  
  图1. A的流分类。拟南芥间期核。 A. SSC面积与DAPI荧光面积的点图 ?表明具有不同DAPI荧光的核的群体反映不同水平的内源多倍体的强度。 B.直方图的DAPI荧光在（A）中作为P1门控的颗粒。各个峰上方的门表示2C，4C，8C和16C的??分选门核。
盖玻片的制备
1. 移取12至15微升的蔗糖缓冲液，22x22毫米高精度盖玻片（Marienfeld）通过橡胶水泥（Marabu）附着在载玻片上（图2A）。
2. 随后移液器等同体积的分选核进入蔗糖缓冲液滴。轻轻地将溶液与a混合移液器尖端
3. 空气干燥的盖玻片在室温下过夜。
4. 盖玻片可立即用于免疫染色或在黑暗中在-20℃下储存长达几个月。

食谱

1 L 1 x PBS
154mM NaCl：9g
7mM Na 2 HPO 4 sup 2 H 2 2H 2 O：1.246g
4mM NaH 2 PO 4：0.48g
在A.dest稀释。并用1N NaOH将pH调节至7.0
甲醛固定剂
4％甲醛的Tris缓冲液（稀释6ml甲醛溶液37％，用50ml Tris缓冲液），固定剂应在即将使用前制备。参加在敞篷下使用甲醛的工作，并妥善处理废物
500ml Tris缓冲液
10mM Tris：0.605g
10mM Na 2 EDTA：1.861g
100mM NaCl：2.922g
0.1％Triton X-100：500μl
在A.dest稀释。并用1N NaOH将pH调节至7.5
200ml裂解缓冲液LB01（Dolezel et al。，1989）
15mM Tris：363mg
2mM Na 2 EDTA：148.9mg
0.5mM Spermin：20.2mg
80mM KCl：1.193g
20mM NaCl：233.8mg
0.1％Triton X-100：200μl
使用1N NaOH将pH调节至7.5，并通过0.22μm过滤器过滤以除去小颗粒。加入220微升β-巯基乙醇，并存储在10毫升等分在-20°C。参加在发动机罩下使用β-巯基乙醇，并妥善处理废物
100μg/ml DAPI储液
通过搅拌60分钟溶解5mg 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）在50ml去离子水中，并通过0.22μm过滤器过滤以除去小颗粒。以0.5ml等分试样在-20℃下储存
25毫升蔗糖缓冲液
10mM Tris：30.3mg
50mM KCl：93.2mg
2mM MgCl 2·6H 2 O：10.2mg/dm 2 5％蔗糖：1.25g
0.05％吐温20：12.5μl
使用5N HCl调节pH至8.0，并以1ml等分试样在-20℃下保存

图2.样品制备，免疫染色程序和显微镜的盖玻片处理。A.通过应用橡胶水泥在载玻片上固定盖玻片; B.加入封闭溶液;光盘。覆盖用石蜡膜。 E.将载玻片置于湿度箱中; F.用刀片切割橡胶骨水泥; G.提起盖玻片; H.在1×PBS中将1％2-巯基乙醇吸移到含盖玻片室的盖玻片中

第二部分。分选的核的免疫标记

材料和试剂

一抗
1. 小鼠单克隆抗RNAPII CTD重复YSPTSPS（1:300）（Abcam plc。，目录号：ab817）以检测无活性的RNAPII分子
2. 鼠单克隆抗RNAPII（磷酸CTD Ser-2）（1:200）（Merck Millipore 公司，目录号：04-1571）以检测活性RNAPII分子
二抗
1. 山羊抗小鼠-Cy5（1:300）（Jackson ImmunoResearch Inc.，目录号：715-175-151）
2. 山羊抗大鼠Alexa488（1:200）（Jackson ImmunoResearch Inc.，目录号：112-545-167）
Milli-Q水
PIPES
MgSO 4 4 /
EGTA（pH 6.9）
BSA
Triton X-100
1x MTSB（微管稳定）缓冲液（见配方）
阻止解决方案（参见配方）
抗体的稀释缓冲液（参见配方）

设备

湿度室
幻灯片比色杯[例如垂直玻璃比色杯（Electron Microscopy Sciences，目录号：70318-04）]

程序

在-20°C储存后，保持盖玻片（在胶片上通过橡胶胶固定）在室温（RT）下10分钟;然后，将它们放在合适的架子上，在60℃的培养箱中干燥45分钟
在玻片比色杯中，在1x MTSB缓冲液中洗5分钟
向每个样品加入60μl封闭溶液，覆盖石蜡膜并在室温下在湿度室中孵育1小时（图2B-E）。
稀释缓冲液稀释一抗。
取出石蜡膜和封闭溶液，然后加入40μl一抗溶液到每个盖玻片，盖上石蜡膜，并在湿度箱中在10°C孵育过夜。
将玻片放入比色杯中，在1x MTSB缓冲液中洗涤盖玻片3x 5分钟
稀释第二抗体，加入40μl的稀释液到每个盖玻片，盖上石蜡膜，并在湿度箱中在10°C孵育过夜。
在玻片比色杯中的1x MTSB缓冲液中洗涤盖玻片1x 5分钟
在乙醇系列中脱水（70％，90％，96％），每次5分钟
空气在黑暗中干燥。

食谱

1x MTSB（微管稳定缓冲液）
50 mM PIPES
5mM MgSO 4 5mM EGTA（pH 6.9）
封锁解决方案
8％BSA
0.1％Triton X-100在1x MTSB中
抗体的稀释缓冲液
1％BSA的1x MTSB缓冲液
以1ml等分试样在-20℃下储存

第三部分。 SIM和PALM评估

该协议基于使用ELYRA PS.1系统与软件ZEN 2012. 2012年。来自其他供应商的系统具有类似的功能。因此，该协议也可以很好地用于包括处理步骤的其他商业系统。在这样的系统上训练时，与这里给出的特定指令的相似性应当变得明显。

材料和试剂

200nm TetraSpeck TM荧光微球幻灯片（Carl Zeiss Microscopy GmbH）注意：TetraSpeck TM荧光微球是Thermo Fisher Scientific的商标。
40nm FluoSpheres改进的微球幻灯片（Carl Zeiss Microscopy GmbH，目录号：1783-456）
40nm FluoSpheres 羧酸酯修饰的微球（Thermo Fisher Scientific）
200nm TetraSpeck TM 微球（Thermo Fisher Scientific，目录号：T-7280）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：63689）
NaCl
2
NaH 2 PO 4 sub
NaOH
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（参见配方）
磷酸盐缓冲盐溶液10x浓缩物（10x PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：P5493）（参见Recipes）

设备

用于22x22mm盖玻片的盖玻片室'Chamlide'（Live Cell Instruments，目录号：CM-S22-1）
显微镜系统Elyra PS.1（Carl Zeiss Microscopy GmbH）

软件

软件ZEN 2012（Carl Zeiss Microscopy GmbH）

程序

样品安装和原子核选择
1. 通过小心地切割橡胶，从幻灯片中取出盖玻片水泥，在一侧具有剃刀刀片并将其从滑块提升（图2F-G）。将盖玻片放入一个22x22毫米的盖玻片室并用1x PBS中的1％2-巯基乙醇覆盖（图2H）。关闭盖子
2. 使用63x/1.4油选择有利的核平面 - 消色差物镜，X-Cite（LED）照明，目镜和应用ZEN工具"Locate"（图3）。
  
  图3。 "定位"显微镜控制。反射荧光的设置光眼检测被激活（黄线）。
用于3D SIM的原始数据采集
使用相同的目标，首先通过随后使用642nm和488nm激光器（用于642nm的51μm栅格和用于488nm激发的34μm栅格）激发，获得SIM图像，然后获得PALM图像（如下一部分所述） 5转）。从较长的波长开始，可最大限度地减少漂白
1. 从工具"定位"切换到工具"采集"，并在中选择 ?'成像设置'工具'SIM'来获取SIM原始数据图像堆栈（图 ?4）。
  
  图4. ZEN'Acquisition'的'Imaging Setup'工具选择"SIM"，使用轨道1进行双轨实验 ?配置642 nm激光
2. 在"频道"工具中定义了使用642 nm激光器作为第一个的多轨实验和用于第二通道的488nm激光器。调整激光功率到?10％，摄像机增益到30 V和Andor iXon885的曝光时间相机到100毫秒查看您的样品。调整激光功率和/或增益if 必要。但使用"范围指示器"以避免过度曝光。在里面 "采集模式"选择适当的帧大小并设置数字的旋转5.如果需要，通过裁剪进一步调整框架尺寸。如果使用裁剪，只集中作业，不使用平移，否则PALM 和SIM卡映像以后将不匹配（图5）。
  
  图5.没有平移的中心裁剪示例
3. 对样本进行对焦，并将焦点定义为中心切片
4. 使用其中一条激光线，在"Z-stack"工具中定义堆叠 ?使用"中心"方法。使用'最佳'按钮满足奈奎斯特 Z切片的标准。我们建议将切片编号设置为使得焦平面稍后作为中心切片的不均匀数量（图6）。
  
  图6. ZEN"Acquisition"的"Z-Stack"工具。选择了"中心"方法。焦点以激活为中心 "中心"按钮和最佳切片厚度（0.110μm）来满足选择奈奎斯特标准。
5. 获取映像堆栈首先使用642nm线，然后是488nm线，这保持漂白至少（图7）。
  
  图7. SIM原始数据。显示的是21个SIM原始切片之一（5个旋转5阶段）从RNAPIISer2ph样品的z-叠加。网格投影是可看见作为在细胞核的条纹。
6. 保存SIM原始数据图像堆栈。
用于3D PALM的原始数据采集
1. 在"成像设置"工具中选择"激光WF"以采集PALM原始图像数据图像堆栈并激活"TV1：EM CCD Andor PALM"按钮（图8）。
  
  图8. ZEN的"映像设置"工具的实验 642nm激光线使用超高功率场（uHP）。安道尔 iXon897相机选择'TV1：EM CCD Andor PALM' 按钮
2. 在中选择适当的框架大小 "获取模式"。自从Andor iXon897相机用于PALM 具有512×512个有效像素，像素尺寸为16μm×16μm，安卓iXon885相机用于SIM有1004 x 1002有源像素与a 像素大小为8μmx 8μm，则x和y中的帧大小必须为一半相比于SIM成像最终得到相同的图像尺寸。对于例如，如果SIM图像是用512×512像素采集的，PALM 图像需要以256 x 256像素进行采样。不要像素点。
3. 从642 nm激光线开始。在"通道"工具中使用低激光 ?功率（高达5％）和高EMCCD增益（200），以重新聚焦样品使用100 ms积分时间。突出的结构可能有帮助重新聚焦。
4. 切换到超高功率场（uHP）以增加功率密度
5. 滑动3D PALM滑块。然后，激活"定焦" 具有连续稳定性以抵消触摸上的任何z漂移屏幕显示（图9）。
  
  图9.通过触摸设置定焦连续操作按"首页"并选择 '设置'。在新屏幕上按"组件"，然后选择"焦点"。按"连续"按钮设置连续操作（A）。移动在3D PALM滑块。然后，激活"定焦" 连续稳定以抵消任何z漂移按"Home" 然后是"显微镜"，然后选择"XYC"并激活按"ON"按钮（B）确定焦点。
6. 定义a 时间序列"工具中的时间序列至少20,000帧。这个帧数主要足以漂白所有可用的分子。如果 ?那么闪烁不会主要消失，增加帧速率相应地。相反，如果所有分子被更早漂白，你可以用更少的帧停止实验
7. 降低EMCCD 安东iXon897摄像机的增益至10 V或更低。将曝光时间设置为 30-50毫秒。将激光功率逐步增加到100％，以避免过度曝光 ?相机。
8. 一旦分子连续进入它们的暗态，增加EMCCD增益，直到你达到200V ?过度暴露。你现在应该看到个别分子闪烁。如果分子重叠，等待这些设置，直到可以在记录之前区分单个分子。如果样品太暗， ?增加到300 V.但是，您应该注意到> 200 V将增加相机噪音。
9. 开始记录时间系列。如果样品不含有基准，控制温度。的 ELYRA PS.1有一个大型孵化箱，其中约30°C。将 2小时后达到。对于在TIRF模式基准中的2D-PALM实验可以加入标记如1：1,000稀释的Tetraspeck珠当它们沉降到玻璃表面并且可以时，方便地到溶液 ?用作漂移校正的标记。对于3D-PALM实验使用不太有用，因为焦点没有靠近玻璃表面。因此，温度应该尽可能稳定以最小化横向漂移。建议孵育样品至少1小时运行实验之前的Elyra孵化器。保存642 nm PALM 时间序列（图10）。
  
  图10. PALM原始数据图像显示的是RNAPIISer2ph样品的20,000个PALM原始图像之一。两个事件，标识为双叶PRLIM PSF（相位边缘定位成像显微镜点扩散函数）被包围。
10. 对488 nm激光线重复步骤3-9。保存488 nm PALM时间序列。
SIM数据处理
1. 将SIM映像堆栈加载到"SIM"处理工具中。
2. 选择"手动"处理，并在菜单"自动噪声过滤器"中， '基线剪切'和'理论'PSF'。保留默认参数值：'SE频率加权'在1.0和'切割'在100/83/83。作为输出图像选择'SR-SIM + Wide-field'来比较分辨率改进。否则只需选择SIM卡图像（图11）。
  
  图11."SIM"处理工具。显示"手动"处理 "自动噪声滤波器"和"基线切割"激活，所有参数均为默认值。反卷积将使用理论PSF和输出将是SIM和宽域图像堆栈。
3. 处理通过激活"应用"按钮的SIM的堆栈。调整亮度和每个通道的对比度并保存。亮度和对比度是最好的 ?通过将限制设置为下限和上限来调整 ?柱状图。
确定SIM分辨率
1. 如果图像中有精细的子分辨率结构，您可以 ?使用它来定义样本中的SIM分辨率。或者， TetraSpeck?荧光微球珠，理想地嵌入样品，可以使用。
2. 将SIM卡映像与宽场图像并切换到"配置文件"视图选项卡。确保在"系统选项"中的"保持"下，应用亮度和对比度 ?到图和表"在"图像显示"选项卡中选择。
3. 识别精细结构，在结构上画一条线。
4. 调整对比度和亮度以使基线为零峰值在40,000或60,000灰度值，因为方便。对于暗淡的样品峰值的调整将为较低的灰度值。
5. 出口将表的表转换为Microsoft Excel并确定全宽半最大值（FWHM），给出分辨率（图12）。
  
  图12.确定SIM分辨率。显示的是一个区域 RNAPIISer2ph染色在结构化照明（SIM）和宽领域（WF）。下图显示了通过子分辨率结构的配置文件 ?其具有对于SIM为?120nm的大小与?250nm in相比的大小 WF，对应于分辨率的一倍。
SIM卡的通道对齐
1. 获得铺在其上的200nm TetraSpeck TM微球的z-堆叠＃1.5盖玻片和嵌入在您选择的硬化树脂中步长为0.11μm，用SIM和相关颜色的41个切片使用'SIM'处理工具处理数据。或者，使用来自Carl Zeiss Microscopy GmbH的200nm TetraSpeck TM微球。这个获取的堆栈将用于校准的颜色偏移系统。偏移将存储在稍后可以使用的模板中以校正实验数据。校准的色偏是特定的为目标和过滤器。因此，需要新的校准当目标和过滤器交换时
2. 加载处理的SIM卡珠的数据进入"通道对齐"处理工具（图 13）。选择"适合"复选框，以便将所有通道对齐第一通道。选择横向（在x，y和z）或仿射（横向 x，y，z&旋转x，y&拉伸x，y）校正为需要
  
  图13. ZEN的"通道对齐"工具 "处理中"。通道2（488 nm）到通道1的偏移量（以像素为单位）（642 nm）可以存储为.bin文件
3. 执行对准。所有通道的偏移量（以像素为单位）第一个通道。按"保存"保存创建的校正模板作为.bin文件供以后使用以补偿用于SIM中的通道之间的任何色差和偏移。以来 ?"通道对齐"工具可识别图像大小以及缩放和偏移位置，可以使用以全帧获取的模板裁剪的示例图片。
4. 评估渠道的质量通过比较多色（TetraSpeck ^TM）珠粒之前和之后的比对对齐后。使用高度校正蔡司计划Apochromat 63x 油/1.4物镜色差低。然而，轻微偏移可以补偿到488之间的小于20nm的偏差 nm和642nm激发（图14）
  
  图14。用488nm和642nm激发记录的TetraSpeck TM TM 微球使用Zeiss Plan Apochromat 63x/1.4物镜SIM后处理通道对齐前后。轻微横向和甚至更小的轴向偏移校正到小于20nm
5. 将样品的SIM图像堆栈加载到"通道对齐" 处理工具作为"输入"（图15）。最方便的图像堆栈可能包含相同顺序的相同通道校正模板被选择用于校正。这样，可以应用存储在模板中的预定偏移需要为通道分配正确的激光识别（ID） SIM图像。如果订单不相同，则必须分配正确的ID ?到每个频道
  
  图15."渠道对齐"工具 ZEN'Processing'。 2通道图像堆栈（激发与488 nm和 ?642nm）和具有相同激光的校正模板以相同的顺序加载。在这种情况下，图像的激光ID 堆栈匹配模板中的激光ID。如果不是这样，必须选择正确的激光ID
6. 取消选择 "合适"复选框和"加载"校正模板（.bin文件）通过校正模板中的值来校正图像通道。不应选择"适合"复选框作为校正模板将不会应用。
7. 通过执行对齐激活按钮"应用"（图16）。该表将显示参考第一通道的通道之间的偏移。注意，因为用于校正模板的珠子在其上盖玻片，折射率不匹配不起作用。如果样品 ?也固定在盖玻片上，获得的校正是可靠的并且嵌入中的差异不重要。应该知道，然而，如果样品固定在载玻片上，折射率不匹配可能有影响。因此，校正可以更少准确。在这些情况下，珠应该嵌入在其中中等作为样本
  
  图16.非活性RNAPII（假有色洋红色）和RNAPIISer2ph（假色为绿色） ?使用模板进行渠道对齐后。修正可见特别是在没有荧光的核仁（n）的边界 ?以及由于在叠加的左侧和上部区域中缺少重叠。
用于3D PALM数据处理的PSF模拟
此过程描述PRLIM方法。对于双平面，散光和双螺旋方法，应用不同的程序。读者在这些情况下必须参考具体的协议
1. 使用由制造商提供的低密度的嵌入的200nm TetraSpeck TM Suppress TM微球载玻片。
2. 聚焦在珠子上，使用焦点位置作为中心堆栈。滑动3D-PALM滑块。你现在应该看到两个平等强烈的叶瓣彼此成45度（图17）。如果需要，重新聚焦。在"Z-Stack"工具中应用"中心"过程。获得a 堆叠的珠子与3D-PALM滑块设置在10纳米步长和 401切片与相应的激光线。这将确保足够奈奎斯特采样
  
  图17. PRLIM PSF。的外观由在PRLIM在焦平面（0nm），500nm下方产生的双瓣PSF （-500nm）以上（+ 500nm）。 PSF的形状编码发射器的z位置。
3. 将堆栈加载到 "实验PSF"的"处理工具"并执行创建平均PSF（图18）。当你滑过堆栈，只有两个叶应该在焦点可见。如果其他信号可见 PSF的边缘，你必须丢弃它并在a获取一个新的堆栈不同的位置
  
  图。 18.实验PSF。在XY，XZ和YZ视图中对许多单个PSF求平均值（A）。的实验PSF将用于模拟创建 '本地化精度表'。在两个靠近的珠的情况下，a 可以考虑第二个胎圈的一部分（B，红色圆圈）导致受损的实验性PSF（C，红色圆圈）。这样不应使用实验PSF。相反，一个新的堆栈少应该获得密集的珠子。或者，一个区域不包括这种靠近的胎圈可以从原件上切掉图片。
4. 将平均PSF加载到'本地化 PALM处理菜单下的精度处理功能执行以获得具有z定位的模拟PSF文件 ?的PSF形状
PALM数据处理，单分子计数和距离测量
此协议描述了ZEN 2012软件中提供的过程。来自其他供应商的软件或免费提供的软件可能包含相同或相似的可能性。请在这些情况下遵循供应商的说明
1. 将PALM时间序列加载到'PALM'处理工具中（图19）。
  
  图19. PALM处理工具。加载了3D PALM数据集，参数设置为显示的值。通过激活'PSF文件' 按钮，加载了带有"本地化精度表"的PSF
2. "3D"处理应由软件自动选择 ?一个3D PALM数据集。它将显示识别的发射器和圆圈他们。每当选择多发射器配件的"重叠帐户" 你看到相交的圆，在3D-PALM中大多数情况下，因为它的PSF比传统的PSF更广泛。使用默认值 "峰值噪声强度"值为6，"峰值掩模尺寸" 从默认值19到15，以最小化重叠的圆。 19是故障安全，但通常两个叶片将适合在大小为15的圆。 ?加载相应的模拟PSF文件并执行处理
3. 使用结果矢量图（PALM图像）在"自动"模式下执行基于模型的漂移校正（图20）。
  
  图20. PAL-Drift视图选项卡。选择了"自动"模式下的基于模型的漂移校正。
4. 将"捕获半径"设置为2像素，对检测到的事件进行分组并且"最大开启时间"和"关闭间隙"设置为4和10帧，（图21）。这对于大多数染料来说是不可能的相同的分子打开超过4帧或关闭超过10 在应用的成像条件下的连续帧。另外，如果两个事件不在两个像素的距离内，则不太可能这两个事件是由同一分子引起的
  
  图21. PAL分组视图选项卡定义过滤器，哪些事件被认为是从同一发射器派生的
5. 渲染图像在10 nm x，y像素大小和40 nm的z到获得具有横向20nm和80nm的分辨率的奈奎斯特采样 ?轴向，对应于可以获得的最大分辨率通过3D-PALM（图22）。如果需要，您可以过滤数据。例如， ?如果要显示显示定位精度的数据在轴向上在10nm和40nm之间和在10nm和80nm之间，在PAL-Filter工具（图23）中为'本地化精度'和'本地化精度z'设置相应的边界。如果有是足够好的局部分子，这产生较高的分辨率图片。存储PALM矢量图。
  
  图22. PAL-Rendering视图标签"像素分辨率"和"显示模式"的选择。
6. 使用"图形"工具视图和定义感兴趣区域选择"PAL-Filter"视图选项卡中的"使用区域"以定义x和 ?y尺寸。另外设置"PositionZ"范围（图23）。
  
  图23. PAL-Filter选项卡视图。活动复选框会将显示的设置应用于图像。
7. 激活'PAL-Statistics'视图选项卡（图24）和向下滚动表到最后一个条目显示的数字（图25）。请注意，建议分组以避免计数分子两次以上。直方图（图26）可以评估估计参数值的分布，它可以帮助设置过滤器和检查数据的质量。对于例如，定位精度的直方图将通知在图像中可实现的分辨率。在图1所示的例子中如图26所示，峰值为约40nm，这是约10倍衍射极限分辨率。此外，直方图指示存在极少的具有非常高的定位精度值的分子， ?它可以通过设置相应的限制过滤掉 PAL-Filter选项卡视图（图23）。
  
  图24. PAL统计 ?视图标签。将显示"表格"和"统计图"选项卡分子表中的参数和直方图/散点图 ?所选参数
  
  图25.统计表。表格列出了具有相应参数的所有事件。最后一个索引表示检测到的分子的总数
  
  图 26.直方图。直方图显示的值分布选择参数。在这个例子中，定位精度是显示
8. 要测量距离，请显示本地化分子作为质心或高斯渲染具有1个像素的'PAL-render' 视图选项卡。使用"图形"线工具来测量两者之间的距离局部分子（图27）
  
  图27.距离测量分子。显示高斯+交叉的PALM矢量图。通过在两个十字之间使用线绘制线来测量距离 '图形'工具。然后，显示长度。
9. 如果观察聚类（最好用彩虹查找表查看时间分子是高斯渲染），使用绘制圆或椭圆图形工具来近似集群的轮廓。请确保轮廓被尽可能最佳地近似。我们的经验测量误差保持在±10％以内。确定中心的质量 ?两个垂直直径（圆）或两个轴（椭圆体）。使用中心来确定之间的距离簇（图28）。
  
  图28.距离测量。群集可以最方便地由a标识彩虹查寻表。它们可以由圆或椭圆近似如图所示（黑色）为小（小圆圈）或大（大圆圈和椭圆）簇。它们的质心可以由两个直径（圆）或轴（椭圆）的交点。连接中心由"图形"工具的一条线显示长度的距离。
PALM的通道比对和分子的共定位
1. 将PALM矢量映射（表）加载到"转换为图像" 处理工具的PALM处理功能并执行将矢量图转换为"czi"图像格式。 '转换成图像"保留如在PALM数据集中定义的体素分辨率。请注意，"通道对齐"处理功能将起作用仅在存在基准标记时在PALM矢量图上
2. 至合并两个PALM通道使用'Copy'Channels'或 '通道对齐'处理工具。在后一种情况下，加载第一个转换的PALM图像作为"输入"，第二个作为"输入2"。如果未选中"适合"复选框，并且"输入2"复选框处于活动状态，两个通道将只是复制在一起，没有一个合适的应用程序激活"应用"（图29）。
图29. ZEN"处理"的"通道对齐"工具。两个通道作为"输入图像"和"输入图像2"加载。如果未选择"适合"框并选择"输入2框"，则两个通道将一起复制为合并的双通道图像。
1. 将合并的通道加载到"通道对齐"工具中。选择 "Fit"按钮将第二个通道与第一个通道对齐。请注意，两个连续PALM图像之间的漂移也是解释为颜色偏移。当没有使用基准时至关重要的是，漂移被保持在最小，以避免任何贡献颜色偏移。 Z-漂移用"确定焦点"补偿，而 ?通过样品的预温育大大减小了侧向漂移 ?在孵育器中保持温度至少1小时孵化器常数。因此，横向漂移小于50nm 期间25分钟（图30）。如果显着结构，如核仁没有荧光，存在，它们可以用于通道通过绘制围绕它们的感兴趣区域来进行对准。
图30.通过"确定焦点"和样品预孵育获得的漂移。帧时间为50 ms。
1. 使用"调整"的"频道偏移"精细调整颜色校正 ?加工工具在"目视检查"下，如果有意义结构可以用作对齐的界标（图31）。或者，如果漂移最小（≤100nm），"通道对准" 工具与加载的校正模板可以按照所述使用 SIM图像。
图31.在漂移校正和通道对准之前和之后的非活性RNAPII（洋红假色）和RNAPIISer2ph（假色），然后基于结构界标（例如核仁= n ）
1. 伪彩色通道，方便地为绿色和品红色共定位。寻找共定位（以黄色显示）。但任何颜色有明显的混合颜色。对于定量使用 ZEN的"Coloc"工具。
SIM和PALM图像的对齐
1. 设置PAL向量图的切片厚度与切片相同渲染视图选项卡中的SIM图像的厚度（图22）。
2. 使用"转换为图像"PALM处理工具将PALM矢量地图转换为"czi"格式图像。
3. 使用"复制通道"工具将SIM和转换的PALM图像复制在一起，并加载到"通道对齐"工具中（图32）。或者，将SIM和转换的PALM图像加载为"输入"和 "输入2"到"渠道对齐"工具中。
  
  图32. ZEN的"通道对齐"工具处理以对齐表示相同结构的SIM和PALM图像
4. 在后一种情况下，当SIM和PALM信道代表相同的结构，对准工具可以用于安装通道一起，如果选择'适合'和'输入2'框。对于"复制" 通道"图像，则只需选择"适合"框。如果突出结构，定义用于比对的感兴趣区域。执行对齐（图33）。
  
  图33.的叠加在SIM图像上的PALM（颜色编码为绿色）（颜色编码为灰色） RNAPIISer2ph通道对齐之前和之后。右侧的插图上部角落是装箱区域的放大视图并显示 RNAPIISer2ph分子的定位网状结构由SIM显示。
5. 如有必要，采用突出结构用于通过目视检查进行微调 "调整"处理工具组的"通道移位"。

笔记

在3D中PALM和SIM图像的对准需要仔细调整用于数据采集的仪器。您必须确保图像大小相同。如果您使用Andor iXon 885相机，其8米像素尺寸的芯片用于SIM和安道尔iXon 897相机，其16米像素用于PALM，PALM的帧尺寸必须是一半（8μm/16μm） SIM。因此，如果以512×512的帧大小记录SIM图像，则PALM图像必须以256×256的帧大小拍摄。这意味着SIM的帧大小在我们的情况下必须可以除以2，获得PALM的帧大小的整数。
在3D PALM实验中，SIM图像堆栈的中心切片必须是焦平面。必须补偿在SIM捕获和以下PALM记录之间发生的z中的任何漂移。在长PALM采集的过程中，主动漂移控制是必要的。当在z中匹配两个图像时，PALM切片厚度必须通过ZEN软件的"PALM-Rendering"视图选项卡精确地适应SIM切片厚度。即使如此，应该意识到在SIM中，通过去卷积（DCV）的光贡献的分配将比分子的定位更精确。因此，存在不匹配结构的机会。对齐一个平面的SIM和PALM图像更可靠。在这种情况下，SIM图像平面用于PALM记录，所有本地化事件可以分配到一个平面
SIM原始数据采集应从较长的波长开始，以尽量减少漂白和交叉激发。
如果在3D-SIM原始数据采集期间需要裁剪，则仅集中裁剪，不使用平移，否则PALM和SIM卡图像以后不匹配。
在3D-SIM原始数据采集期间，切片数目必须设置为不均匀的数目，以使焦平面稍后作为中心切片。
如果用于校正模板的珠在盖玻片上，则不出现折射率不匹配。如果样品也固定在盖玻片上，获得的校正是可靠的。然而，如果样品固定在载玻片上，折射率不匹配可能具有影响。因此，校正可能不太准确，并且珠应该嵌入在与样品相同的介质中
要执行PALM的通道对准和分子的共定位，请注意，仅当存在基准标记时，"通道对准"处理功能才能在PALM矢量图上起作用。

食谱

磷酸盐缓冲盐溶液10x浓缩物（10x PBS）
1x溶液通过在ddH 2 O中10倍稀释制备

致谢

我们感谢Andrea Kunze和Joachim Bruder的优秀技术援助。该协议是基于以前发表的Schubert（2014），Schubert和Weisshart（2015）的工作开发的。

参考文献

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Jackson，D.A.，Hassan，A.B.，Errington，R.J.and Cook，P.R。（1993）。人类核内转录的聚焦位点的可视化 EMEM （3）：1059-1065。
Papantonis，A.和Cook，P.R。（2013）。转录工厂：基因组组织和基因调控 Chem Rev 113（11）：8683-8705。
Rieder，D.，Trajanoski，Z.和McNally，J.G。（2012）。转录工厂前基因 3：221. < br />
Schubert，V。（2014）。 RNA聚合酶II在黑麦和拟南芥中形成转录网络 Cytogenet Genome Res 143（1-3）：69-77。
Schubert，V。和Weisshart，K。（2015）。 RNA聚合酶II在拟南芥间期细胞核中的丰度和分布。 a> J Exp Bot 66（6）：1687-1698。
Zhao，Z.W.，Roy，R.，Gebhardt，J.C.，Suter，D.M.，Chapman，A.R。和Xie，X.S。（2014）。 RNA聚合酶II在哺乳动物细胞核内的空间组织通过反射光片超分辨率显微镜显示。/a> Proc Natl Acad Sci USA 111（2）：681-686。