材料和试剂

1％乙烯气体（SCOTT Specialty Gases，目录号：01-04-855）
1L Tedlar PLV气体取样袋w/Thermogreen LB-2 Septa（Sigma-Aldrich，Supelco，目录号：24633）
1.5ml Microtubes（Corning，Axygen ，目录号：MTC-150-C）
1ml无针注射器（BD，目录号：309659）
25 G针（BD，目录号：305122）
15ml聚丙烯离心管（Greiner Bio-One GmbH，目录号：188271）
16mm直径×100mm玻璃管（VWR International，目录号：47729-576）
18mm直径×150mm玻璃管（VWR International，目录号：47729-583）
Suba-Seal septa（Sigma-Aldrich，目录号：Z124613）
番茄植物（4-5周龄）在温室或生长室（16小时光照，25?28℃）中生长
（Xcv）菌株85-10野生型和突变体（例如，III型效应物缺失突变体）
注意：野生型菌株可应要求提供。
氯化镁六水合物（Sigma-Aldrich，目录号：M2393）
蛋白胨（BD，目录号：211677）
酵母提取物（BD，目录号：212750）
琼脂（BD，目录号：214530）
甘油（Certified ACS）（Fisher Chemical，目录号：G334）
氢氧化钠（Sigma-Aldrich，目录号：221465）
蒸馏水
NYGA介质（参见配方）
10mM MgCl 2（参见配方）

设备

28oC培养箱（VWR International，目录号：414005-128）
Vortexer（Scientific Indrustries，型号：Vortex-Genie 2）
分光光度计（Amersham Biosciences，型号：Ultrospec 3100 Pro）
气相色谱仪（GC）（Shimadzu Corporation，型号：GC-8A）

程序

细菌接种物制备和接种
1. 使用a。从-80℃甘油储备液中划出每个Xcv菌株灭菌的牙签放到独立的无菌NYGA琼脂板上适当的抗生素，并在28℃的培养箱中生长2天
2. 对于每种分析的菌株，悬浮一部分细菌细胞琼脂平板使用消毒的牙签或移液管吸头在1ml的10 mM MgCl 2在1.5ml微管中。涡旋细胞悬浮液和通过使用a检查其在600nm处的光密度（OD大于600）分光光度计。为了制备接种物，稀释细胞悬浮液与10mM MgCl 2以获得OD 600 = 0.2。（不同接种物浓度应该根据经验测试最佳乙烯生产。）
3. 用10mM接种中间叶的每个小叶 MgCl 2（模拟接种）或使用1ml无针的细菌接种物 ?注射器（图1）。小心地除去表面上的多余溶液与薄纸的传单。在同一分支上使用传单与叶龄的对照比较。对于统计分析，准备a 最少三次生物学重复
  
  图1.用不需要的注射器进行手浸润
4. 将接种的植物移植到植物生长室或温室中（?25-28℃，16h天/8h夜间循环）。
乙烯气体测量
1. 在接种后0,2和3天（dpi），切除小叶（模拟或Xcv感染的）并测量它们的重量。
2. 卷每个小叶，然后将其放入玻璃管（16毫米直径×100毫米）30分钟，没有密封。
3. 然后用Suba-Seal Septa塞子盖住每个玻璃管（图2）。
  注意：重要的是使用最小尺寸的玻璃管来减少 ?体积的气体空间以浓缩各自排放的乙烯传单。
  
  图2.在带有隔垫的玻璃管中滚动的传单
4. 在室温下孵育玻璃管1小时。
5. 使用连接到1ml注射器的25号针头，取出1ml 来自每个玻璃管的气体样品（图3）并将其注入气体中色谱
  
  图3.从带有隔垫的玻璃管取样气体
6. 使用公司使用手册检测乙烯[例如 Shimadzu的 GC使用说明书（ https://store.shimadzu.com/p-52629- instruction-manualgc-8apfgc-8a.aspx ）]。
使用标准曲线
测量乙烯
1. 使用1％乙烯罐上的针头附件泵送乙烯气体进入Tedlar包。标签袋为标准1.最终浓度标准1 = 1％= 10,000nl乙烯/ml
  
  图4.将乙烯气体泵入Tedlar袋
2. 从填充乙烯的Tedlar袋中取1ml 1％乙烯将其注入到带盖的玻璃管（18mm直径×150mm玻璃管带有Suba-seal隔垫）。标签管为最终浓度标准2 = 0.0352％或352nl乙烯/ml。（空的加盖管含有27.4ml空气。标准品2中的乙烯浓度= 1％/1ml ?+ 27.4ml。）
3. 从盖玻璃管（标准2; 18毫米）取1毫升直径×150mm玻璃管，具有Suba-seal隔片），并将其注入（18mm直径×150mm玻璃管） Suba-seal septa）。标准品3的最终浓度= 0.00124％或12.4 nl乙烯/ml
4. 在GC上注入1 ml的每种标准品并测定峰面积。
5. 通过绘制峰面积（X轴）由nl乙烯（Y轴）构建标准曲线。
6. 使用标准曲线，确定每个中的乙烯的水平接种小叶。乙烯含量定义为nl乙烯/克的鲜重/小时。代表性的结果可以在Lund等人 al。（1998）（图1C和图2C）和Kim等人（2013）（图 1A-B）。

食谱

NYGA培养基（1L）
蛋白胨5 g
酵母提取物3 g
琼脂15克
甘油20ml
加入蒸馏水补足1 L
用1N氢氧化钠调节pH至7.0 通过高压灭菌20分钟灭菌培养基
10mM MgCl 2/
氯化镁六水合物2.03克
加入蒸馏水补足1 L
通过高压灭菌20分钟灭菌培养基

致谢

该协议从Lund等人（1998）采用。 W. Stork由美国农业部NIFA拨款2012-67011-19669支持。 M. B. Mudgett得到国立卫生研究院资助2 R01 GM068886-06A1的支持。

参考文献

Kim，J.G.，Stork，W。和Mudgett，M.B。（2013）。 Xanthomonas type III effector XopD desumoylates tomato transcription transcription SlERF4 to suppress ethylene responses and promoting pathogen growth。 a> Cell Host Microbe 13（2）：143-154
Lund，S.T.，Stall，R.E.and Klee，H.J。（1998）。乙烯调节番茄中对病原体感染的敏感反应。 /em> 10（3）：371-382。
Stork，W.，Kim，J.G。和Mudgett，M.B。（2015）。黄单胞菌核心III型效应子XopX对植物防御的抑制和激活的功能分析。 Mol Plant Microbe Interact 28（2）：180-194