材料和试剂

细针（Bonn Micro Probes）（Fine Science Tools，目录号：10030-13）
盖玻璃（Matsunami Glass Ind，目录号：C024241）
野生型小鼠（日本SLC，型号：C57BL/6JJmsSlc）
异氟烷（例如，Wako Pure Chemical Industries，目录号：099-06571）
用于局部麻醉的利多卡因溶液（80mg/ml）（例如Xylocaine Pump Spray 8％）（AstraZeneca）
牙科用水泥（Super-Bond C& B）（Sun medical）（GC's Global，UNIFAST II）
电压敏感染料（OPTICAL IMAGING LTD，目录号：RH1691）
NaCl
KCl
MgCl 2 ^。 6H <2> O
CaCl 2 ^。 2H O
HEPES
蒸馏水
RH1691
林格的解决方案（参见配方）
电压敏感染料（VSD）溶液（见配方）

设备

异葎草的麻醉系统（Shinano，目录号：SN-487-0T）
用于切割鼠标毛的电动剪刀（ Panasonic Corporation，目录号：ER803P）
反馈控制加热垫（Bio Research Center，目录号：BWT-100A）
注意：垫子监测鼠标体温，并将其保持在所需的温度。
头支架（立体定位装置）（NARISHIGE Group，型号：SG-4N）
精剪刀（Fine Science Tools，目录号：91460-11）
学生Dumont＃7镊子（Fine Science Tools，目录号：91197-00）
Dumont＃5SF镊子（Fine Science Tools，目录号：11252-00）
棉签用于吸收戒指的溶液
用于去除振铃溶液的真空泵（例如AGC TECHNO GLASS CO。，型号：VPUMP-140）
手术刀（例如：Kai industries，目录号：310-A）
头固定板（手工制作，图1A）
板架（定制，图1B）
立体显微镜（OLYMPUS，型号：SZX7）
绿色LED灯（REVOX Inc.，型号：SLG-50S-G）
牙钻（SHOFU Inc.，型号：Tas-35LX）
牙轮钻（SHOFU Inc.，型号：ELA Steel Bur HP-1）
镜头鼓风机（例如HAKUBA，型号：KMC-45）
超快CMOS成像系统（Brainvision，型号：MiCAM ULtima）
注意：对于参考成像（参见过程步骤13），通过506nm二向色镜用蓝色LED光（中心波长：465nm）照射皮质;绿色荧光通过536/40-nm滤光片校正。
对于电压敏感染料成像，用红色LED光（中心波长：625nm）激发VSD荧光。激发光用632/22-nm带通滤波器过滤，使用655nm二向色镜反射，并且在皮质表面下聚焦375μm。荧光用665nm长通滤光片过滤。
蓝色LED灯（Brainvision，型号：LEX2-B）
红色LED灯（REVOX Inc.，型号：SLG-50S-R）
刺激器（例如，NIHON KOHDEN CORPORATION，型号：SEN-5201）
用于后爪刺激的金属电极（手工制作，图1C）
涡旋混合器（例如Scientific Industries Inc.，型号：VORTEX-GENIE 2）

图1.头部固定设备。 A.手工头部固定板; B.定制板架; C.用于后爪刺激的手工金属电极

软件

采集软件（Brainvision，型号：UL-Acq）
分析软件（Brainvision，型号：BV_Ana）

程序

所有动物实验根据机构指导进行，并由来自RIKEN BSI的动物实验委员会批准。

手术准备（时间，60-70分钟）
1. 麻醉鼠标与异氟烷（1-2％，vol/vol在空气中）
2. 用电动剪刀剪头发上的头发。
3. 将鼠标放在加热垫（37°C），暂时稳定头部带有头部支架的耳杆，并将鼻孔插入麻醉管（图2A）。我们没有使用鼻夹 ?头架。
4. 使用剪刀，去除覆盖两个半球头骨的皮肤（直径约1厘米）（图2B）。
5. 将利多卡因溶液应用于伤口。
  注意：不要将利多卡因应用于大脑，因为它阻断了电压门控钠通道并抑制VSD反应。
6. 用刮刀轻轻取出骨膜颅骨（图2B）。这将有助于胶水粘在骨头上。
7. 用牙科骨水泥将头部固定板粘在暴露的颅骨上（Super-Bond C& B）（图2C）。不要让任何间隙颅骨和水泥，以防止溶液泄漏
8. 干燥后牙齿粘固剂（约10分钟），将小鼠转移到板夹，将头部固定板固定在板支架上，并保持身体用加热垫在37℃的温度下（图2D）
9. 做一个通过大量涂布和堆积牙科水泥（UNIFAST II）作为一个 ?围绕头部固定板孔排列（高度约1或2mm）（图2E）。该室将通过填充用于染色腔室与电压敏感染料（VSD）溶液（步骤D15）
  
  图 ?2.开颅手术的实验准备。 A.头发在头已被切。 B.除去皮肤和骨膜。 C.的头部固定板已经附接到暴露的头骨上。 D.的小鼠已转移到板支架，并进行头部固定板已被固定。 E.腔室已经用牙科水泥制成 ?到头部固定板上。
切开术（时间，20-40分钟）
1. 在右半球的大部分上进行开颅手术（详情如下所示）。在开颅手术期间，绿色LED灯源（中心波长：525nm）可以帮助使血管可视化避免手术损伤。我们没有控制脑肿胀。
  1. 使用a ?牙钻（头直径：0.8mm），通过刮削形成凹槽头骨和一个岛在右半球（图3A）。
    注意：防止钻孔产生的热损伤，你不应该钻孔颅骨连续在同一地点（最大5秒）。这是有帮助的使用林格氏溶液或通过使用空气冷却钻孔区域鼓风机。
    注意：这个凹槽在这一步不会穿透头骨。
  2. 通过用细镊子轻轻地推动岛上来检查沟槽的头骨厚度
  3. 如果岛上轻轻推动时小心上下移动用细针头划伤凹槽，以便切割带槽的头骨。
  4. 填充室用一个ringer的解决方案润湿头骨，这使我们能够很容易地从头骨去除岛
  5. 使用细镊子从颅骨的其余部分去除岛（图3B和3D）。
    注意：不要触摸大脑，并保持硬脑膜完整，以避免 ?损伤。当皮质血管损伤时，您可以看到血液在硬膜物质下传播。在这种情况下，你应该准备一份新鼠标并重复此过程。
  6. 轻轻洗净暴露皮质与振荡器的解决方案，直到表面皮层血管 ?变得清晰可见（图3C）
  7. 如果硬脑膜上的血液不能用洗涤去除，轻轻干燥暴露的硬脑膜 ?镜头鼓风机，并重复步骤B10f-g，直到清除（图3C）注意：此程序有助于止血。
    
    图3.宽视场皮质VSD成像的切开术。A.有凹槽的头骨（右半球）。 B.表层血管立即开颅后。 C.洗涤后的血管。 D.删除 ?头骨。
2. 将鼠标传输到录音设置（ epi荧光显微镜）与加热垫，固定头固定，并将异氟烷浓度降至1.0％（在空气中的体积/体积）麻醉实验。对于清醒动物的实验以下步骤不进行麻醉注意：心率应进行监测，麻醉水平应控制在防止意外死亡和获得良好的反应。
找到感兴趣区域（ROI）进行成像（时间，10分钟）
1. 给振动室注入振铃溶液，并在溶液上放置一层薄的玻璃盖
2. 用荧光显微镜搜索ROI并捕获ROI VSD成像前的图像。这是因为VSD在下一次染色步骤使皮质变暗（图4），研究人员不能精确地在皮质上创建活动图。
  注意：皮层上表面血管的位置可以是反应区的参考（图5）。
VSD染色（定时，2.5小时-3小时）
1. 取下盖玻片，并将振铃器溶液从腔室中吸出
2. 用VSD溶液填充室，并在室上放置薄的盖玻片以避免干燥（图4A）
3. 将铝护套覆盖在腔室上以保持腔室不受光照（图4B）。
  注意：小心不要让气泡进入VSD溶液，以防止不规则染色。
4. 应用VSD溶液90分钟，以便染料溶液通过硬脑膜物质到达皮质。
5. 取出VSD溶液，并每15分钟用一次冲洗室新鲜的ringer溶液除去未结合的染料，直到溶液变成 ?透明（60-90分钟）。
6. 洗涤后，用振荡器溶液填充室，并在溶液上放置薄的盖玻片（图4C）。
  
  图4.VSD染色。A.填充有VSD溶液的室盖用一个薄的盖玻璃。 B.房间被一个铝护套。 C.清洗皮质后，开颅手术与振动器的解决方案和覆盖着薄盖玻片。
皮层VSD成像（时间，取决于您的实验）
1. 记录皮层活动（图5A）。电刺激对侧后爪3秒后开始成像，并监测 VSD响应4秒（刺激前3秒和刺激后1秒刺激）（图5B）。通过引用位置的血管（步骤C13;图5C），重叠皮层活动图和血管位置，以便识别功能皮质图（图5D）。
  
  图5. VSD的示例麻醉下的成像 A.在VSD期间的实验配置麻醉下成像。 B.皮层VSD的时空动力学通过对侧后爪刺激诱发的反应（单脉冲，0.1 ?ms持续时间，100V）。刺激后的时间是表示。以2-ms时间和80-μm空间收集图像解析度。字母A和P表示前和后方向。点表示前囟位置。 C.的表面血管。 D.重叠图像。

笔记

为了防止染料对神经元的光毒性，应当使激发光的强度和曝光时间最小化。当我们每40秒使用4秒的暴露时间时，我们可以获得2小时的稳定成像。正确洗涤未结合的染料有助于提高单一信噪比。然而，过度洗涤降低了稳定的成像时间。

食谱

林格氏溶液（pH7.2，NaOH）
将7.89g NaCl（135mM），0.40g KCl（5.4mM），0.20g MgCl 2 .6 6H 2 O（1mM）溶解，，0.26g CaCl 2·2H 2·2H 2 O（1.8mM）和1.19g HEPES（5mM）的蒸馏水溶液，总共音量1 L
储存在4°C
使用前温暖至体温
电压敏感染料（VSD）溶液（2mg/ml）
将10毫克RH1691溶于5毫升振荡溶液中，并用涡流混合器混合储存于-20°C，保持阴暗
温热至体温，在使用前用涡旋混合器混合

致谢

该协议改编自Manita等人（2015）。作者确认来自JSPS（日本科学促进会），上原纪念基金会和日本奖基金会的来自青年科学家的助学金（A）的支持。从用于挑战探索研究的Grant-in-Aid从JSPS到T. S.

参考文献

Manita，S.，Suzuki，T.，Homma，C.，Matsumoto，T.，Odagawa，M.，Yamada，K.，Ota，K.，Matsubara，C.，Inutsuka，A.，Sato， Ohkura，M.，Yamanaka，A.，Yanagawa，Y.，Nakai，J.，Hayashi，Y.，Larkum，MEand Murayama，M.（2015）。从自上而下的皮层回路获得准确的感官知觉。 Neuron 86（5）：1304-1316。