材料和试剂

0.1-10μl移液管吸头（Thermo Fisher Scientific，目录号：QSP＃TF104）
1-200μl和100-1000μl移液器吸头（分别为Corning，目录号：4845和4846 ）
0.2ml 8条PCR管和盖子（NIPPON Genetics，目录号：FG-028DC ）
1.5ml和2.0ml微量离心管（分别为Corning，目录号：MCT-150-A和MCT-200-C >
15ml和50ml离心管（Corning，目录号：352096和352070 ）。
96孔快板（NIPPON Genetics，目录号：38801）
1ml注射器（MonotaRO Co.，NIPRO Genetics，目录号：08-010）
人肝细胞嵌合小鼠（PhoenixBio Co.）
注意：嵌合小鼠静脉内感染来源于慢性肝炎患者的100μl的在盐水溶液中的HBV-C（每只小鼠10个拷贝）（Sugiyama et al。，2006）。
HBV（基因型C; HBV-C）（名古屋市立大学医学研究生院，日本名古屋的病毒学和肝脏单位的Yasuhito Tanaka博士; Sugiyama等人，2006） br />
氯化钠（Nacalai tesque，目录号：31320-05）
YSK脂质（pH敏感性阳离子脂质）（北海道大学药学部，札幌，北海道，日本）（Sato等人，2012）
胆固醇（Avanti Polar Lipid，目录号：57-88-5）
1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油甲氧基聚乙二醇（PEG-DMG）（NOF Corporation，目录号：GM-020）
核酸酶游离-H 2 O 2 /
柠檬酸盐缓冲液（12.5mM柠檬酸盐，500mM NaCl）
pCpGfree-mcs载体（Invivogen）
载体构建用引物
pLKO.1 Fw SpeI：CCCACTAGTTTTCCCATGATTCCTTCATATTT
pLKO.1 Rv BglII：CCCAGATCTAAAATTGTGGATGAATACTGCC
TaqMan Universal PCR Master Mix（Life Technologies，目录号：4304437）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems?，目录号： 4304437 "。
用于HBV感染的嵌合小鼠血清中HBV DNA定量的引物和探针：
正向引物：SF2：5'-CTTCATCCTGCTGCTATGCCT-3'
反向引物：SR2：5'-AAAGCCCAGGATGATGGGAT-3'
探针：SP2：FAM-ATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAG-TAMRA
MISSION pLKO.1-puro空载体质粒DNA（Sigma-Aldrich，目录号：SHC001）
DNA寡核苷酸（5'-3'）
检测：CCGGTGTACATGTCCCACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTTTTG
反义：
AATTCAAAAATGTCCATGCCCCAAAGCCACCCAAGGCACAGCTTGGAGGCTTGAACAGTGGGACATGTACA
寡核苷酸（参见配方）

设备

生物安全3级（BSL3）设施（HITACHI，目录号：SCV-1303 ECIIB）的生物安全罩
移液管（PIPETMAN P2，P20和P1000）（Gilson Scientific，目录号：F144801，F123600和F123602）
qPCR粘合密封（NIPPON Genetics，目录号：4Ti-0560）
Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler（Life Technologies，目录号：4375786）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems?，目录号： 4375786 "。
ABI StepOnePlusTM实时PCR系统（Life Technologies，目录号：4379216）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems?，目录号：

程序

εRNA-MEND制剂
1. 将寡核苷酸退火并插入AgeI-EcoRI 双重消化的pLKO.1-puro载体。用连接的载体，U6 启动子和εRNA编码片段通过PCR扩增引物对（pLKO.1 Fw SpeI：CCCACTAGTTTTCCCATGATTCCTTCATATTT; pLKO.1 Rv BglII：CCCAGATCTAAAATTGTGGATGAATACTGCC），PCR产物为用SpeI和BglII消化并插入到pCpGfree-mcs载体中。该最终构建体在下文中称为p-εRNA
  
  图1.U6启动子驱动的εRNA表达载体（p-εRNA）的质粒图
2. 载于脂质体载体中的p-εRNA的制备是基于对先前描述的程序（Sato et al。，2012）： p-εRNA或空pCpGfree-mcs载体配制成脂质纳米颗粒（MEND）。 80μgp-εRNA或空载体（在H 2 O中）用120μl柠檬酸盐缓冲液（12.5mM柠檬酸盐，500mM NaCl）溶解。将该溶液加入480μl含有叔丁醇的溶液中 YSK脂质（2,100nmol），胆固醇（900nmol） 2-二肉豆蔻酰-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇（150nmol） ?脂质体颗粒的自发制剂（εRNA-MEND或 control-MEND）。将制备的εRNA-MEND在4℃下储存备用。

感染HBV的人肝细胞嵌合小鼠
注意：涉及操作HBV感染性材料的所有程序都应在生物安全柜（BSL3）内进行。
嵌合小鼠用源自慢性肝炎患者的盐水溶液（每只小鼠10个拷贝）中的100μl的HBV-C静脉内感染（Sugiyama等人，2006 ）。在HBV感染三周后，通过从尾静脉收集血液样品制备血清，并通过qPCR分析测量HBV感染的嵌合小鼠的血清中病毒基因组拷贝的数目来确认感染的效率，如下：

准备HBV DNA标准样品：
HBV质粒（pUC19-HBV，基因型A）在核酸酶中进行10倍系列稀释从1×10 3至1×10 9个拷贝/ml的游离-H 2 O，并使用10μl的该稀释的样品（范围从1×10 3至1×10 7个拷贝/测定）标准定量HBV DNA。

按如下所述设置qPCR反应混合物（对于一个样品）：
来自HBV感染的嵌合小鼠血清的DNA样品：

核酸酶游离-H 2 O 2 /	6微升
TaqMan通用PCR主混合物	12.5μl
探针SP2（10μM）	0.5μl
正向引物SF2（10μM）	0.5μl
反向引物SR2（10μM）	0.5μl
HBV DNA样品（来自血清）	5微升
	25μl

标准DNA样品：

核酸酶游离-H 2 O 2 /	1微升
TaqMan通用PCR主混合物	12.5μl
探针SP2（10μM）	0.5μl
正向引物SF2（10μM）	0.5μl
反向引物SR2（10μM）	0.5μl
标准DNA：	10微升
总计	25μl

注意：使用10μl的无核酸酶的-H2O代替标准DNA作为阴性对照。每个样品一式三份制备。

按照以下程序开始实时PCR：

控制阶段
95°C
10分钟

1个周期

循环阶段
95°C
15秒

45个周期

60°C
1 min
数据收集

最后等待阶段
4°C
∞

使用εRNA的体内治疗
在感染后4周，以每两天0.5mg/kg体重（每组n = 3）的剂量静脉内施用εRNA-MEND或对照MEND，持续14天。血清和肝脏样品可以进行qPCR以定量HBV的DNA拷贝数或其他分析

食谱

用于p-εRNA质粒构建的DNA寡核苷酸

	序列（5'→3'）
感觉	CCGGTGTACATGTCCCACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTTTTG
反义	AATTCAAAAATGTCCATGCCCCAAAGCCACCCAAGGCACAGCTTGGAGGCTTGAACAGTGGGACATGTACA

致谢

从Sato等人（2015）改编的该协议部分地基于Sato等人（2012）和Sugiyama等人的早期着作al。（2006）。这得到了来自日本教育，文化，体育，科学和技术部的资助（授予科学研究资助[A] [25253030] to AT，Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas [25115502,23112701] AT，Grant-in-Aid for Young Scientists [B] [25870015]至SS）。

参考

Bartenschlager，R。和Schaller，H。（1992）。肝炎病毒组装由聚合酶与病毒RNA基因组中的衣壳化信号结合引发。 EMBO J 11（9）：3413-3420。
佐藤， ?S.，Li，K.，Kameyama，T.，Hayashi，T.，Ishida，Y.，Murakami， Watanabe，T.，Iijima，S.，Sakurai，Y.，Watashi，K.，Tsutsumi，S.，Sato， Y.，Akita，H.，Wakita，T.，Rice，C.M.，Harashima，H.，Kohara， Tanaka，Y。和Takaoka，A。（2015）。 RNA传感器RIG-I双重作为乙型肝炎病毒的先天传感器和直接抗病毒因子。免疫力 42（1）：123-132。
Sato，Y.，Hatakeyama，H.，Sakurai，Y.，Hyodo，M.，Akita，H.and Harashima，H。（2012）。 pH敏感性阳离子脂质促进脂质体siRNA的递送以及体外和体内的基因沉默活性。 163（3）：267-276。
Sugiyama， ?M.，Tanaka，Y.，Kato，T.，Orito，E.，Ito，K.，Acharya，S.K.，Gish， G.，Kramvis，A.，Shimada，T.，Izumi，N.，Kaito，M.，Miyakawa，Y。 Mizokami，M。（2006）。乙型肝炎病毒基因型对病毒DNA和抗原的细胞内和细胞外表达的影响。 a> 44（4）：915-924。