材料和试剂

材料

0.1-10μl移液管吸头（Thermo Fisher Scientific，目录号：QSP＃TF104）
1-200μl和100-1,000μl移液管吸头（Corning，目录号：分别为4845和4846）
Falcon 12孔组织培养板（Corning，目录号：353043）
Biocoat胶原I细胞制品12孔板（Corning，目录号：356500）
1.5ml和2.0ml微量离心管（Corning，目录号：MCT-150-A和MCT-200-C）
15ml和50ml离心管（分别为Corning Incorporated，目录号：352096和352070）
96孔快板（NIPPON Genetics，目录号：38801）

试剂

肝细胞培养和HBV感染
1. 原代人肝细胞（PHH）（PhoenixBio Co.）
2. HepG2-hNTCP-C4细胞（Takaji Wakita和Koichi Watashi博士，Department of Virology II，National Institute of Infectious Diseases，Tokyo，Japan; ?Iwamoto等人，2014）
3. Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）（NISSUI PHARMACEUTICAL，目录号：05919）
4. DMEM/F-12 + GlutaMax（Life Technologies，目录号：31331-028）注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Gibco?，目录号： 31331-028 "。
5. 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（Life Technologies，目录号：15630-080）
  注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Gibco?，目录号： 15630-080 "。
6. 胎牛血清（FBS）（Life Technologies，目录号：10437-028）
  注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Gibco?，目录号： 10437-028 "。
7. G418（Nacalai tesque，目录号：09380-86）
8. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）
9. HBV质粒（pUC19-HBV，基因型C）（Dr. Yasuhito Tanaka，Department ?名古屋市立大学研究生院病毒学与肝脏科医学科学，名古屋，日本; Sugiyama ，2006）
10. FuGENE 6转染试剂（Promega公司，目录号：E2692）
11. Opti-MEM I还原血清培养基（Life Technologies，目录号：31985-070）
  注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Gibco?，目录号： 31985-070 "。
12. QIAamp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN，目录号：51104）
13. 聚乙二醇8000（PEG8000）（Sigma-Aldrich，目录号：81268）
14. PHHs培养基（参见食谱）
15. HepG2-hNTCP-C4培养基（参见配方）
包膜HBV DNA提取
1. 核酸酶游离-H 2 O 2 /
2. 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）（Nacalai tesque，目录号：35406-91）
3. NP-40（Nacalai tesque，目录号：25223-75）
4. 乙酸镁（MgOAc）（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：130-00095）
5. 乙二胺四乙酸（EDTA）（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：345-01865）
6. 蛋白酶K（Life Technologies，目录号：25530-015）
  注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Invitrogen?，目录号：
7. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：191-07145）
8. 氯化钠（NaCl）（Nacalai tesque，目录号：31320-05）
9. 脱氧核糖核酸酶I（DNase I）（Promega Corporation，目录号：M6101A）
10. 核糖核酸酶A（RNase A）（Life Technologies，目录号：12091-021）
  注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Invitrogen?，目录号： 12091-021 "。
11. 苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）（Sigma-Aldrich，目录号：P2069）
12. 氯仿（KANTO CHEMICAL，目录号：07278-00）
13. 乙酸钠（NaOAc）（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：198-01055）
14. 糖原（Roche Diagnostics，目录号：10901393001）
15. 异丙醇（Nacalai tesque，目录号：29113-53）
16. 乙醇（99.5％）（Nacalai tesque，目录号：14713-95）
17. 裂解缓冲液（见配方）
用于定量HBV DNA的qPCR
1. SYBR Premix Ex Taq（2x）（Tli RNase H Plus）（Takara Bio Company，目录号：RR420）
2. ROX参比染料（50x）（Takara Bio公司，目录号：A9701A）
3. 通过定量PCR扩增衣壳化HBV DNA的引物正向：5'-CTTCATCCTGCTGCTATGCCT-3'
  反向：5'-AAAGCCCAGGATGATGGGAT-3'
  （产物长度：222bp，产物Tm：83.5℃）

设备

37℃和5％CO 2细胞培养箱（WAKENBTECH CO。，目录号：9000EX）中。
移液管（PIPETMAN P2，P20和P1000）（Gilson Scientific，目录号：F144801，F123600和F123602）
高速冷冻微型离心机（KUBOTA Corporation，目录号：3500）
涡旋混合器（Labnet Internationa，目录号：vx100）
Shaker（Tokyo Rikakikai Co.，EYELA，目录号：MMS-110）
双铝块槽（SCINICS CORPORATION，目录号：ALB-301）
ABI StepOnePlus ^TM实时PCR系统（Life Technologies，目录号：4379216）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems?，目录号： "4379216
qPCR粘合密封（NIPPON Genetics，目录号：4Ti-0560）

程序

肝细胞培养和HBV感染
1. HBV制备和HBV病毒滴度的测量：
  1. 种子Huh7 ?细胞至10-cm培养皿，1×10 6个细胞/培养皿，补充DMEM培养基 ?用10％FBS稀释，并在37℃，5％CO 2培养箱中培养。
  2. 后 24 h培养，每皿用10μgHBV转染Huh7细胞质粒（pUC19-HBV-C）在Opti-MEM I还原血清培养基中通过FuGENE 6 根据制造商的方案转染。
  3. 在3 ?转染后天，在50ml管中收获培养基并通过在4℃下以5,000rpm离心5分钟。上清液含有可以将HBV储存在-80℃直到用于感染。
  4. 对于检测收获的上清液的HBV DNA拷贝，100μl 上清液与1μlMgOAc（600mM），0.5μlRNA酶A（20mg/ml）混合， ?μlDNA酶I（1单位/μl），37°C孵育3小时以去除HBV 质粒。通过加入2μlEDTA（0.5M，pH 8.0）终止反应，并在65℃温育10分钟。然后使用提取HBV DNA QIAamp DNA Blood Mini Kit，以及HBV滴度由qPCR确定（程序C.用于定量HBV DNA的qPCR）。
2. HBV感染的种子细胞：
  PHH购自PhoenixBio Co.，Ltd。（Hiroshima，Japan）和接种在具有1ml PHH的biocoat胶原I细胞器12孔板上培养基作为1×10 5个细胞/孔。产生HepG2-hNTCP-C4细胞 ?由Drs。 Takaji Wakita和Koichi Watashi（Iwamoto等人，2014），以及接种在具有1ml HepG2-hNTCP-C4的12孔组织培养板上培养基以1×10 5个细胞/孔。细胞在37℃下在37℃下培养 ?5％CO 2 - 培养基
3. HBV感染：
  24小时后，PHHs或将HepG2-hNTCP-C4细胞在37℃下与HBV原液温育24小时含有适当数目的基因组当量（GEq）的等分试样，其用1ml补充有4％PEG的培养基稀释在温育结束时，细胞用洗涤三次培养基，并收获用于分析。
  注意：PHH或HepG2-hNTCP-C4细胞分别以10或100 GEq /细胞感染。

包膜HBV DNA提取

取出培养基，用冷PBS洗涤细胞两次
加入裂解缓冲液300μl/孔
在冷室（4℃）下以200rpm/min摇动20分钟以破坏细胞
转移所有细胞裂解物到新的1.5毫升管。
通过在4℃下离心（15,000rpm）2分钟沉淀颗粒核和不溶性级分。
收获上清液到新的1.5毫升管（在冰上）

按以下顺序混合：

混合顺序		体积（μl）
1	核酸酶游离-H 2 O 2 /	20
2	样品上清	250
3	100mM MgOAc	18
4	核糖核酸酶A（20mg/ml）	2
5	DNase I（1单位/μl）	10
	总计	300

孵育混合物样品在37℃下6小时。（此步骤后，样品可保持在4℃）
加入30μlEDTA（100mM，pH8.0）并在65℃下孵育15分钟以终止反应
在4℃下以15,000rpm离心10分钟，然后将所有上清液收获到新管中

按以下顺序混合：

混合顺序		体积（μl）
1	样品上清液	300
2	10％SDS	40
3	核酸酶游离-H 2 O 2 /	18
4	5M NaCl	8
5	蛋白酶K（20mg/ml）	4
	总计	400

在55°C孵育混合物样品2小时以消化HBV核心 ?蛋白质并从核心颗粒释放病毒基因组
加入400μl苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），彻底涡旋约1分钟
在室温下以15,000rpm离心5分钟。
小心地将上层转移到新管。
加入400μl氯仿，彻底涡旋约1分钟
在室温下以15,000rpm离心5分钟。
小心地将上层转移到新管。
加入40μlNaOAc（3M，pH 5.2），1μl糖原（20μg/μl）和400μl异丙醇。
只需涡旋并放在冰上20分钟。
在4℃下以15,000rpm离心20分钟。
小心地清除上清液而不干扰沉淀
加入500μl的70％乙醇，在4℃下以15,000rpm离心样品10分钟。
小心地尽可能除去上清液。
在室温下干燥沉淀20分钟。
用100μl无核酸酶的H 2 O 2重悬沉淀并短暂旋转 ?以收集样品。（纯化的衣壳化的HBV DNA可以是储备液在-20℃。

用于定量HBV DNA的qPCR

准备HBV DNA标准样品：
HBV质粒（pUC19-HBV）是在无核酸酶游离-H 2 O范围内进行10倍系列稀释从0.2×10 3至10 10拷贝/μl（1μgHBV质粒（pUC19-HBV）含有 1.46×10 11个DNA拷贝，http：//www.endmemo.com/bio/dnacopynum.php）。和这些稀释的样品用于构建标准曲线 HBV DNA的定量。
对于每个qPCR模板，用无核酸酶的H 2 O 2对纯化的壳体化的HBV DNA样品进行100倍稀释。

设置以下反应混合物用于qPCR分析以测量HBV DNA的拷贝数（对于一个样品）：

核酸酶游离-H 2 O 2 /	3.8μl
2x SYBR Premix Ex Taq	10微升
50x ROX参比染料	0.4μl
正向引物（10μM）	0.4μl
反向引物（10μM）	0.4μl
稀释的HBV DNA样品或标准DNA样品	5微升
总共	20微升

注意：使用5μl的核酸酶游离-H 2 O而不是DNA样品作为阴性对照。每个样品一式三份制备。

PCR板用粘性透明盖覆盖，然后短时间离心

在实时仪器中设置板，并按照以下程序启动实时PCR：

控制阶段	95°C	10秒		1个周期
循环阶段	95°C	5秒		45个周期
循环阶段	60°C	30秒	数据收集	45个周期
熔体曲线阶段	95°C	15秒		1个周期
	60°C	60秒	60°C→95°C时的数据收集
	95°C	15秒	60°C→95°C时的数据收集

食谱

PHHs培养基
补充有10％FBS的DMEM 100 U/ml青霉素
100μg/ml链霉素 20 mM HEPES
44mM NaHCO 3/v/v 15μg/ml L-脯氨酸 0.25μg/ml胰岛素 50nM地塞米松 5ng/ml表皮生长因子（EGF） 0.1mM Asc-2P 2％二甲基亚砜（DMSO）
HepG2-hNTCP-C4培养基
补充有10mM HEPES的DMEM/F-12 + GlutaMax 200 U/ml青霉素
200μg/ml链霉素 10％FBS
50μM氢化可的松
在400μg/ml G418存在下5μg/ml胰岛素
裂解缓冲液
1％NP-40
1mM EDTA
50mM Tris-HCl（pH7.4）

致谢

从Sato等人（2015）改编的该方案基于Turelli等人（2004）和Sugiyama等人（2004）的早期着作，。（2006）。这得到了来自日本教育，文化，体育，科学和技术部的资助（授予科学研究资助[A] [25253030] to AT，Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas [25115502,23112701] to AT，Grant-in-Aid for Young Scientists [B] [25870015]至SS）

参考文献

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Sugiyama，M.，Tanaka，Y.，Kato，T.，Orito，E.，Ito，K.，Acharya，SK，Gish，RG，Kramvis，A.，Shimada，T.， M.，Miyakawa，Y.and Mizokami，M。（2006）。乙型肝炎病毒基因型对病毒DNA和抗原的细胞内和细胞外表达的影响。 a> Hepatology 44（4）：915-924
Sato，S.，Li，K.，Kameyama，T.，Hayashi，T.，Ishida，Y.，Murakami，S.，Watanabe，T.，Iijima，S.，Sakurai，Y.，Watashi， Tsutsumi，S.，Sato，Y.，Akita，H.，Wakita，T.，Rice，CM，Harashima，H.，Kohara，M.，Tanaka，Y.and Takaoka， RNA传感器RIG-I双重作为乙型肝炎病毒的先天传感器和直接抗病毒因子。免疫力 42（1）：123-132。
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