材料和试剂

离心管
无菌1 ml注射器（针头取出）
无菌细菌培养管
植物材料
本塞姆氏烟草，番茄（品种Moneymaker）
注意：种子可以从Yule Liu的实验室获得。
细菌菌株
1. 大肠杆菌：DH5α，ccdb 存活（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：A10460）
2. 根癌农杆菌：GV3101，GV2260（GV3101的替代品）
  注意：所有菌株均可从Yule Liu的实验室获得。
质粒
1. pTRV1（Dong等人，2007）：包含2×35s的T-DNA载体启动子，Nos终止子和TRV RNA1的完整cDNA（来自Ppk20菌株）
2. < pTRV2e（Sha et al。，2014）：含有2×35s启动子的T-DNA载体， ?Nos终止子和TRV RNA2的cDNA克隆，其中亚基因组来自豌豆早期棕色病毒（PEBV）的外壳蛋白的启动子（Wang等人， ?1997）和连接非依赖性克隆（LIC）盒紧接在TRV CP基因的下游
3. pTRV2e-GFP：GFP 基因在LIC盒中插入pTRV2e。这个结构可以用于 ?控制测定显示成功的外源表达
4. pTRV1 （拟南芥，ABRC，目录号：CD3-1039）和pTRV2e（拟南芥， ABRC，目录号：CD3-1866）载体可以订购拟南芥生物资源中心（ABRC，http://www.arabidopsis.org/）。
文化媒体
1. 液体Luria-Bertani（LB）培养基
  具有1.5％琼脂的固体LB培养基平板注意：在加入适当的抗生素之前，将LB培养基在120℃下高压灭菌20分钟。
抗生素
1. 卡那霉素（Sangon Biotech，USP Grade）
2. 利福平（Sangon Biotech，USP Grade）
3. 庆大霉素（Sangon Biotech，USP Grade）
PCR试剂
1. EasyTaq DNA聚合酶（Beijing TransGen Biotech，目录号：AP112）
2. EasyPfu DNA聚合酶（Beijing TransGen Biotech，目录号：AP211）
3. dNTP Mix（Roche Diagnostics，目录号：04729706103）
浸润试剂
1. 二甲基亚砜，DMSO（AMRESCO，ACS级）
2. MgCl 2（北京化工，分析纯）（参见配方）
3. 2-（N-吗啉代）乙磺酸，MES（AMRESCO，Regent Grade）（参见配方）
4. 乙酰丁香酮（3,5-二甲氧基-4-羟基苯乙酮）（AS）[Sigma-Aldrich，Purity（HPLC）]（参见配方）
5. 浸润缓冲液（见配方）

设备

植物生长室（24℃，16小时/8小时光/暗光周期，40-80％湿度）
离心机
PCR仪
37℃和28℃振荡孵育器

程序

TM设计。
1. 通过添加3-4个核苷酸经验地设计TM分子进入与第10位相反的位点之间的互补序列第11个nt的目标miRNA。
  保持其他位置与基准配对到miRNA。
  注意：图1显示了TM设计的示例。
图1. TM设计的示例。A.Mi3的TM DNA序列（TM319）。 B. TM319和Nbe-miR319的碱基配对。红色字母是插入到与第10和第11个nt（由" - "表示）相对的位点之间的互补序列中的核苷酸。
克隆。
1. 如先前研究中所述将miRNA TM片段插入到LIC盒中的pTRV2e中（Sha等人，2014）。
2. 通过PCR筛选正确的构建体，并且必须通过DNA测序来确认。
质粒提取
1. 将正确的克隆在2?5ml液体LB培养基（含有50μL）中生长 μg/ml卡那霉素）中，在200rpm振荡16小时。
2. 收集细菌并使用碱性裂解法（Sambrook，2001）提取质粒。
土壤杆菌转化
1. 将pTRV1，pTRV2e或其衍生物分别转化到农杆菌菌株GV3101（或GV2260）中。
2. 在28℃下在固体LB培养基（含有50μg/ml卡那霉素，50μg/ml利福平）上生长2天。
3. 通过PCR使用确认土壤杆菌含有所需的质粒并在LB平板上划线正确的转化体。
农业渗透物的制备
1. 生长包含pTRV1，pTRV2e或pTRV2e的正确转化体衍生物（Sha等人，2014，图1）在5ml液体LB培养基中（含50μg/ml卡那霉素，50μg/ml利福平）在200rpm振荡培养箱过夜。
2. 收集文化并将每个农杆菌培养物调整至OD 600 = 1.0。混合均匀 pTRV1的土壤杆菌培养物的体积（OD <600 = 1.0）和pTRV2e的体积或pTRV2e衍生物。
3. 通过在室温下以3,000xg离心5分钟来对混合的农杆菌进行离心。
4. 弃去上清液并用等体积的浸润缓冲液重悬细胞沉淀（以保持OD <600>≈1.0）。
5. 在室温下孵育重悬的农杆菌2.5-6小时注意：将农杆菌接种到培养基中以进行培养在清洁工作台上，使用的所有设备都需要是无菌的。
植物渗入。
1. 选择6叶期植物用于VbMS测定。渗透重新悬浮的农杆菌进入3-4扩展叶的后轴侧（避免中间静脉）用1毫升不必要的注射器。
图2.土壤杆菌渗入
示意图
植物生长和miRNA沉默效应的评价
1. 在24℃下以16小时/8小时光/暗光周期生长浸润的植物，并且光强度为200μmol/m 2 -2s -1 s -1。
  在接种后2-3周，靶miRNA将在整个植物水平上沉默。
2. 新发展的器官将显示强烈沉默的表型的相应miRNA。这些组织可以适当使用实验注意：图2显示了一个示意图渗透程序。每个叶通常在2-4个位点注射在整个叶片中，每个注射部位具有> 1cm的直径

食谱

1 M MgCl 2
溶解在100ml ddH 2 O中的20.33g MgCl 2·6H 2 O，通过120℃高压灭菌， 20分钟，储存在4℃
1 M MES
21.325g溶解在100ml ddH 2 O中的MES，通过0.22μm膜过滤灭菌，在室温下贮存。
200mM乙酰丁香酮（AS）
0.3924g AS溶解在10ml DMSO中，在-20℃下以1ml等分试样储存
渗透缓冲液（10mM MgCl 2，10mM MES，200μMAS）
加入1ml MgCl 2（1M），1ml MES（1M），100μlAS（200mM），加入ddH 2 O至100ml。 />

参考文献

Liu，Y.，Schiff，M.，Marathe，R。和Dinesh-Kumar，S.P。（2002）。烟草Rar1，EDS1和NPR1/NIM1样基因是N介导的烟草花叶病毒抗性所必需的。 Plant J 30（4）：415-429。
Sambrook，J。（2001）。分子克隆：实验室手册，第三版。冷泉港实验室出版社。
Sha，A.，Zhao，J.，Yin，K.，Tang，Y.，Wang，Y.，Wei，X.，Hong，Y.and Liu，Y.（2014）。植物中基于病毒的微RNA沉默植物生理 164（1）：36-47。
Wang，D.，MacFarlane，S.A.and Maule，A.J。（1997）。豌豆早期褐变病毒种子传播在豌豆中的病毒决定因素病毒学 234（1）：112-117。