材料和试剂

苗圃子叶单发伤害
1. 无菌6cm×6cm尼龙网，200μm孔径（Lanz-Anliker AG，定制）
2. 标准9厘米圆形培养皿
3. 3M ^TM胶带，1.25cm×9.14m，低过敏胶带，标准卷（3M，目录号：1530-0）
4. 两个25G×5/8"皮下注射针，0.5mm×16mm（BD Bioscience，目录号：305760）
5. 拟南芥无菌种子， g/ 记者行（Gasperini等人，2015）
6. 无菌双蒸水H 2 O（ddH 2 O）
7. Murashige和Skoog（MS）培养基（Duchefa Biochemie，目录号：M0221.0050）
8. MES水合物（Sigma-Aldrich，目录号：M8250）
9. 琼脂（AppliChem GmbH，目录号：A2111 1000）
10. 标准9cm圆形培养皿，装有30ml固体半强度Murashige和Skoog（0.5x MS）培养基和0.7％琼脂食谱）
苗木子叶的重复性伤害
1. 3M Micropore ^TM胶带，2.5cm×9.14m，低过敏胶带，标准卷（3M，目录号：1530-1）
2. 一个25G×5/8"皮下注射针头，0.5mm×16mm（BD Bioscience，目录号：305760）
3. 一个36号斜角NanoFil针，110μm外径（World Precision Instruments，目录号：NF36BV）
4. 标准12cm×12cm正方形培养皿
5. 用于垂直增长的机架（例如 Milian，目录号：086680）
6. 拟南芥无菌种子，例如 CYCB1; 1p-GUS 报告基因线（Colón-Carmona et al。）
7. 无菌ddH 2 O 2 /
8. 标准12cm×12cm正方形培养皿，填充有具有0.85％琼脂的70ml 0.5×MS（参见Recipes）
GUS染色
1. 染色皿[例如12孔悬浮培养板（Greiner Bio-One GmbH，Cell Star ，目录号：665102）]
2. 冰桶冰
3. 显微镜载玻片（例如 Thermo Fisher Scientific， Menzel-Glaser，目录号：AD00000112E）和盖玻片（例如 Thermo Fisher Scientific，Menzel-Glaser，目录号：BB024060A1）
4. 90％（v/v）丙酮在ddH 2 O 2中
5. 50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）
6. 70％（v/v）乙醇（EtOH），在ddH 2 O中
7. 亚铁氰化钾[例如三水合六氰基铁（II）酸钾（Sigma-Aldrich，目录号：60279）]
8. 亚铁氰化钾[例如六氰基铁酸钾（III）（Merck Millipore Corporation，目录号：104973）]
9. 5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡萄糖醛酸（X-Gluc）（例如Biosynth，目录号：B-7300）
10. 水合氯醛（例如Sigma-Aldrich，目录号：23100）
  安全注意事项：急性毒性，避免吸入。
11. 甘油（例如Sigma-Aldrich，目录号：G6279）
12. GUS染色溶液（参见配方）
13. 氯化物水合物溶液（见配方）

设备

无菌罩（层流罩）
精细镊子样式4（例如 Dumont，目录号：0508-4-PO）
微量移液器（P20，P200，P1000）
植物生长室或植物生长室设置有以下生长条件：21℃，100μEm -2 s -1 s -1光强度，14小时光照/10小时黑暗光周期< br />
便携式解剖立体显微镜
真空泵
37℃孵育器
立体显微镜[例如：徕卡显微系统公司，型号：Leica MZ16A，配备相机（型号：DFC310FX）]
微分干涉对比（DIC）显微镜[例如，徕卡显微系统公司，型号：Leica DM5500，带有照相机（型号：DFC420）]

程序

苗圃子叶单发伤害
注意：步骤1-3必须在无菌条件下在无菌罩下进行。
1. 要在培养基上等距播种，请在培养皿下放置印刷导管（文件1A ）。

苗木子叶的重复性伤害
注意：步骤B1-4必须在无菌条件下在无菌罩下进行。

要在媒体上等距播种，请在培养皿下方放置印刷的指南（ File 1B ）。

重悬无菌种子在500μl无菌ddH 2 O中，并且等分铺板两行30个种子各自在具有P20微量吸液管组的固体0.5x MS培养基（0.85％琼脂）上以分配20μl的体积（图2A）。
注意：如果一个点上有多于一粒的种子在网格上喷出，可以吸出和重新定位多余的种子。

用2.5cm宽的微孔胶带密封板，分层2天黑暗在4℃（保持板水平，种子面向上），在早晨转移到生长室，垂直生长3天 ?（图2B）。
注意：样品可以保存在黑暗中，包装在铝箔中。

在第三天的早上（7-8 am），小心地打开盘子在无菌条件下，将其水平放置并缠绕在便携式下解剖立体显微镜。最小化苗移动和支持样品，将皮下注射针放置在子叶下空心面向下，并使用NanoFil针刺穿子叶（图2C）。与实践，大约需要6分钟到伤口60棵幼苗（1个平皿）

关闭板，返回生长室，并保持垂直生长。

在交替子叶上每12小时重复创伤程序，每个幼苗总共5个创伤（图2D）。

在最后5次伤口保持幼苗在生长室中2小时 ?诱导CYCB1; 1启动子驱动的GUS报告基因活性。搜集幼苗使用镊子，轻轻地提起他们在下胚轴 - 子叶界面，避免组织的额外伤口或挤压。分析每次处理30-40棵幼苗。

小心转移5-10 幼苗一次进入GUS染色液注意不要损伤根尖。在37℃在黑暗中孵育2小时。

通过用1ml 50mM替换GUS染色溶液停止反应 ?磷酸钠缓冲液pH 7.0。样品可以在4℃储存几小时 °C，但应尽快成像。

在显微镜载玻片上装载新鲜制备的水合氯醛溶液并用DIC显微镜拍照

图2.垂直生长的拟南芥幼苗的重复子叶伤口将种子接种在生长培养基（A）上并垂直生长分层后3天（B）。用NanoFil刺穿幼苗针在交替子叶上每12小时（C），导致5可见伤口（D）。比例尺= 0.5mm。

代表数据

表达 ?的MYC2p-GUS 报告基因通常限制于根，下胚轴和叶原基的基部（图3A; Gasperini等人，2015），但单子叶伤口诱导进一步激活上述地面组织，包括子叶和 ?上部下胚轴（图3B）。重复子叶伤口导致a 由于减少的分生组织细胞数而导致的根长度减少与较低的CYCB1; 1p-GUS显示的细胞周期基因CYCB1; 1（Gasperini等人，2015）的表达降低有关;在处理的幼苗的根分生组织中（图3C-D）

图3.在对照（A）和单子叶受伤幼苗（B）中的MYC2p-GUS 报道基因活性。 ?GUS酶将X-Gluc转化为蓝色产物显露位点的转录活性。橙色星号表示伤口现场。 CYCB1; 1p-GUS 报告基因表达对照（C）和经受重复子叶伤害的幼苗（D）。 ?比例尺= 0.5mm（A，B）; 50μm（C，D）。

笔记

的 ?尼龙网作为大卷出售，应该切成片所需尺寸。几个（8-16）网片可以用铝包裹箔并通过高压灭菌一起灭菌。网可以用清洗 ?使用后运行自来水并重复杀菌多次
任何其他无菌电镀技术都是合适的
长期 ?孵化样品在水合氯醛中会改善澄清植物组织可以储存在此溶液中1-2个月。然而，根尖的成像应在10-15分钟后完成安装在新鲜的水合氯醛中，分生细胞将开始
可以执行重复性创伤在较长的时间段（> 5个伤口）中的较长的幼苗中因为有足够的组织伤口

食谱

0.5x MS固体培养基
2.15 g/L MS
0.5g/L MES水合物
ddH _{2到最终体积
用10M KOH调节pH至5.7 加入琼脂至7g/L（水平板，9cm圆）或8.5g/L（垂直板，12cm正方形）。
高压灭菌器
冷却至55-65℃，倒入板}
GUS染色溶液
注意：准备新鲜，保持在黑暗中。
50mM磷酸钠缓冲液pH7.0 10mM EDTA pH 8.0 0.1％Triton X-100 3 mM氰亚铁酸钾
3 mM铁氰化钾
0.5mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡糖苷酸（X-Gluc） ddH _{2 到卷}
水合氯醛溶液
8克水合氯醛
2ml甘油 1ml ddH 2 O 2 /

致谢

单一伤口方案由Acosta等人（2013）和Gasperini等人（2015）的重复伤口方案开发。这项工作得到了瑞士国家科学的支持基金会赠款31003A-138235给E.E.F.我们感谢A.Chételat，A. Kurenda和C. T. Nguyen的摄影和视频援助。

参考文献

Acosta，I.F.，Gasperini，D.，Chetelat，A.，Stolz，S.，Santuari，L.and Farmer，E.E。（2013）。 NINJA在根茉莉酸信号中的作用。 Proc Natl Acad Sci USA 110（38）：15473-15478。

Colon-Carmona，A.，You，R.，Haimovitch-Gal，T.and Doerner，P。（1999）。技术进步：使用不稳定的细胞周期蛋白-GUS融合蛋白的有丝分裂活性的时空分析。 a> Plant J 20（4）：503-508。

Gasperini， ?D.，Chetelat，A.，Acosta，I.F.，Goossens，J.，Pauwels，L.，Goossens， A.，Dreos，R.，Alfonso，E.and Farmer，E.E。（2015）。茉莉酸信号传导的多层组织在根生长调节中的作用。 PLoS Genet 11（6）：e1005300。

Larrieu， ?A.，Champion，A.，Legrand，J.，Lavenus，J.，Mast，D.，Brunoud，G.， J.，Guyomarc'h，S.，Pizot，M.，Farmer，E.E.，Turnbull，C.，Vernoux， ?Bennett，M.J。和Laplaze，L。（2015）。荧光激素生物传感器揭示植物中茉莉酮酸信号的动态。 Nat Commun 6：6043.