材料和试剂

棉花
1 ml微量吸头
Hyp O O - 半乳糖基化肽或蛋白质
0.22 M Ba（OH）2
0.32M硫酸
1 M NaOH
1 M HCl
10％氨水
含有0.1％甲酸的80％乙腈
含有0.1％甲酸的99.9％乙腈（HPLC级）
含有0.1％甲酸的水（HPLC级）

设备

热块
离心蒸发器
BT AG 50W-X8树脂（100-200mg树脂，H +型）（Bio-Rad Laboratories，目录号：143-5441）
微量离心机
微HPLC系统（JASCO International Co.，型号：micro21 LC-01）
LCQ Deca XP-plus ESI离子阱质谱仪（Thermo Fisher Scientific）
TSK-gel Amide-80（3μm）柱（2.0×150mm）（Tosoh Bioscience LLC，目录号：21865）

程序

Ba（OH）2水解
1. 将溶解于500μl0.22M Ba（OH）2中的半乳糖基化的肽溶解在带盖的玻璃小瓶中。
2. 在105℃，6小时孵育。
3. 在冰上孵育5分钟。
4. 在冰上加入500μl0.32M硫酸
5. 以20,000×g离心5分钟。
部分纯化Ba（OH）2水解产物（图1）
1. 用少量棉花插入1ml微量吸头。
2. 将200 mg AG 50W-X8树脂装入吸头柱。
3. 通过重力流动用1ml 1M NaOH洗涤柱
4. 通过重力流动用1ml 1M HCl洗涤柱子。
5. 通过重力流量用1ml水洗涤柱子。
6. 将半乳糖基化肽的Ba（OH）2水解产物的上清液应用于尖端列。
7. 通过重力流量用1ml水洗涤柱子。
8. 通过重力流动用1ml 10％氨水洗脱
9. 将样品蒸发至干。
10. 溶于100μl含有0.1％甲酸的80％乙腈中
  
  图1. Ba（OH）2水解产物的部分纯化。上清液将半乳糖基化肽的Ba（OH）2水解产物应用于 ?尖柱。
LC/MS分析
通过LC-MS使用连接到LCQ Deca XP-plus ESI离子阱质谱仪的微HPLC（高压液相色谱）系统分析10μl等分试样的测定溶液。色谱分离通过在TSK-凝胶Amide-80（3μm）柱（2×150mm）上的正相HPLC进行。
1. 流动相由含0.1％甲酸的HPLC级水组成（洗脱液A）和含有0.1％甲酸的HPLC级乙腈（洗脱液B）。柱温度保持在25℃
2. HPLC流速为100μl/min，洗脱梯度在10分钟内为60至40％B
3. 使用正离子模式的HPLC洗脱液进行耦合电喷雾电离（ESI）。
4. MS的源参数如下：
  1. 毛细管温度：200 V
  2. 毛细管电压：42 V
  3. 源电压：5 kV
  4. 源电流：8.5μA
  5. 鞘气流量：50
  6. 辅助气流量：0
  7. 扫气流量：0
  8. 质量范围： m/z 500-2000
    
    图2.在水溶液中检测Hyp em O - 半乳糖苷在Ba（OH）2水解产物中的通过LC-MS分析体外半乳糖基化AGP14。通过选择分析样品 ?Hyp（m/z <132.1）和Gal-Hyp（m/z <294.1）的离子监测。 Ba（OH）2水解产生非对映体对的氨基酸
5. 质谱通过在缩放扫描模式中选择的离子监测（Hyp：m/z 132.1，Gal-Hyp：m/z 294.1）获得。

致谢

这是Ogawa-Ohnishi和Matsubayashi（2015）描述的用于检测HPGT活性的详细方案。这项研究由教育，文化，体育，科学和技术部的科学研究资助（S）支持（No. 25221105）。

参考文献

Ogawa-Ohnishi，M。和Matsubayashi，Y。（2015）。在拟南芥中鉴定三种有效的羟脯氨酸O-半乳糖基转移酶。 Plant J 81（5）：736-746。
Ogawa-Ohnishi，M.，Matsushita，W。和Matsubayashi，Y。（2013）。在拟南芥中鉴定三种羟脯氨酸O-阿拉伯糖基转移酶。 Nat Chem Biol 9（11）：726-730。