材料和试剂

17×100mm，14ml用于细菌的培养管
次氯酸钠（商业Bleach-Clorox）
大豆种子（William 82）（大豆）
发根土壤杆菌菌株K599（自制培养物）
PRAP15，pRAP17或其他质粒
盐酸四环素， 95％（Sigma-Aidrich）
Murashige& Skoog Medium - 包括维生素（Duchefa Biochemie，目录号：P08805.02）
乙醇（The Warner Graham Company，Gas，目录号：64-17-5）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：64-17-5"。
抗菌皂（清洁&光滑）
MS盐
3％蔗糖
酪蛋白消化蛋白胨
酵母提取物
磷酸二钾（K 2 HPO 4）
磷酸钾（K 3 PO 4）
甘油
KOH
MS介质（参见配方）
Terrific Broth，Modified（Research products International Corp.，目录号：31237）（参见配方）
Fertilizer-Peters Excel 13-2-13 150ppm氮（pH 6.1）（参见配方）

设备

162盆平托盘和32个盆栽平台（迈尔斯草坪花园）
Promix灵活用途（Pro-Mix，型号：Flex松散2.8立方英尺）
加热生长垫（家庭仓库）
1L培养瓶（Pyrex）
分光光度计UV-120-02（Shimadzu Coopration，目录号：204-00010-08）
用GSA转子离心机（型号：Sorvall RC-5B制冷超速离心机）
塑料巴斯德移液管（Corning，Falcon ，目录号：357575）
连接真空泵的干燥器
G10 Gyrotory振动器（New Brunswick Scientific）
Gyrotory水浴摇床（LabX，New Brunswick Scientific，型号：G76）
铲斗（家得宝）
生长室
不锈钢剪刀（Roboz Surgical Instrument Co.，目录号：RS-5912）
Dark Reader Spot Lamp-SL85（Clare Chemical Research）
橙色滤光镜（Clare Chemical Research）
天井/摊铺机砂。多用途（Pavestone）
分光光度计（Shimadzu Coopration，型号：UV-120-02）
50 ml一次性塑料杯
清除塑料桶
旋转平台
Thermo Fisher Scientific Nalgene球形底部离心瓶，聚碳酸酯（PC）-Jade Scientific Inc./Nalgene TM球形底部聚碳酸酯离心瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：3123-0250）
真空380 mm Hg（Torr）

程序

准备大豆苗
1. 根据需要计数大豆种子，每个DNA构建体约162个种子。对种子进行排序以去除患病，小或损坏的种子。除去杂草种子和其他外来物质。大概数量的大豆cv。 Williams 82种子可以使用22.5的重量来测定克等于100粒种子。来自其他大豆品种的种子可以具有a 不同重量每100粒种子。浸泡大豆种子消毒 10％漂白10分钟。 300ml 10％漂白剂在1L塑料烧杯中适用于高达约300克种子。将种子添加到漂白剂中 ?溶液，短暂地旋转以沉下种子，并允许种子休息静静地为剩下的曝光。倒掉漂白溶液。 ?将种子用RO快速连续冲洗约10次 [反渗透]水除去漂白剂。或者，运行RO 水倒入烧杯中直到其充满并且种子悬浮。继续运行RO水进入烧杯约20秒。排出 ?水从种子。重复4次。排出种子好，但轻轻。 ?轻轻处理种子，因为它们现在是脆弱的
2. 植物大豆种子转化前7?9天。种子发芽和幼苗在夏天生长更快，而在慢冬季。在9×18细胞平，植物每个细胞含2个种子水合Promix灌封介质。因此，一个8×18单元平面提供用于两个构建体的足够的植物（324）。通过混合水合Promix 用水在5加仑桶。
  将162电池平放在干净 ?表面，并用水合Promix填充各个盆，包装 ?每罐用坚固的压力，每罐使用一个手指。填写更多 ProMix使它与平顶的水平。形成一个洞来种植种子通过用一个特大的锐利的笔钻出Promix 类似于2厘米的深度。植物每个细胞2粒种子;轻轻用ProMix覆盖种子;并根据需要添加更多ProMix来覆盖。的 ?覆盖ProMix轻轻放置，不按压。浇水播种直到Promix中度饱和。将162锅平放直接在生长台或加热生长垫上，没有任何开放下面的单位。不要再把水弄平，直到顶层 Promix已开始变干为浅棕色。轻轻地，水需要，直到植物出现（图1）注意：在夏天，在马里兰州，美国，幼苗在7天或8天天准备好了种植。此时，第一子叶叶部分打开。 ?在冬季和寒冷季节，幼苗可能不在正确的阶段，直到种植后第9天或第10天天，您可以使用在冬季加热发芽垫。
  
  图1.种植后7天的大豆（William 82）幼苗
准备农杆菌文化
1. 在转化周前一周准备小的发根土壤杆菌培养物。
  用A接种5ml合适的培养基。毛根纲。对于A的培养物。含有pRAP15构建体的毛霉属菌株K599 （图2），将插入片段克隆到基因表达载体中 pRAP15之间的attR1和attR2位点设计用于定向克隆。在这个载体中，玄参花叶病毒（FMV）启动子驱动插入基因的表达。使变换的可视化根，载体含有编码增强绿色荧光的基因蛋白质由产生强根的rol D启动子控制表达。编码四环素抗性（TetR）的基因提供抗生素选择。接种到TB [Terrific Broth]培养基中 μg/ml四环素。生长每个克隆的两个培养管，每管5ml， ?在73°F?74°F [22.8?23.3℃]的温度范围内。的培养温度不得上升至明显高于77°F [25°C]或 ?K599可以驱逐或修饰质粒。在约200摇动管 rpm。使用圆底17 x 100毫米14毫升培养管设计细菌以避免细菌结块。孵化时间为 ?约48至50小时
2. 准备大型文化的A。毛根纲。
  转化前一天或两天，使用5ml培养物接种300ml Terrific Broth（TB）培养基-5μg/ml四环素每个克隆在约73°F至74°F下过夜温育[22.8℃ 23.3℃]。接种大文化与一个或两个小培养取决于培养浓度。孵育温度 ?不得显着超过77°F [25°C]或K599可能会排出或修饰质粒。将1L培养瓶在160rpm和2L下振荡 ?将烧瓶在140rpm振荡12小时。检查OD ₆₀₀;他们应该在 0.5?0.6的范围。培养物可以在4℃保存1-2小时，直到 ?需要。
  注意：在转换前一天，如果实验室温度预计高于75°F [24°C]，打开空气空调冷却房间和MS媒体。 MS媒体是保持在室温或75°F [24℃]。检查小植株转化为疾病。删除具有黄色子叶的小植株区域，非常高的细茎，或任何其他属性，将使他们 ?弱。小植株应该是深绿色，厚，无瑕疵子叶和厚茎。如果小植物的强度不够严格的转化，用新鲜种子再次种植植物并准备新的细菌培养物。
3. 倒入培养物上盖 ?设计用于GSA转子并平衡它们。离心机5000 rpms [4,068×g ]在4℃下30分钟收集 A。毛根纲。（后 ?这一点细菌培养不再是无菌的。）
4. 将沉淀重悬在20ml MS培养基中。使用一次性塑料巴斯德吸管轻轻地重悬培养。转移约15ml 再悬浮培养至190ml MS。通过旋转混合。读取OD ₆₀₀。用MS将培养物浓度调节至大约OD 600 = 0.5至0.6 媒体。
用土壤杆菌转化大豆幼苗的基础

在温室中种植大豆苗
1. 在种植大豆苗之前，在桶中预先湿润ProMix ?用温室自来水填充三个32个单元格单元内穿孔的标准平板/DNA构建体。 ProMix应该是相当湿;甚至sodden。用稳定的手压力将ProMix装入锅中。 ?就在种植植物之前，用水喷洒ProMix 喷壶。使用记号笔作为钻头，创建2到3厘米的孔 ProMix用于植物插入。将植物插入ProMix中约2至3厘米，或靠近子叶，轻轻压缩 ProMix下来用四个手指环绕茎。种植后植物，用喷壶彻底洒上ProMix。种植日为天0.
  注意：不要将ProMix与Biofungicide一起使用。它可能干扰涉及线虫和真菌的根的测定。
2. 浇水植物轻轻地用喷壶前4天后种植在ProMix。在第5天用魔杖切换到浇水 ?用纯水在ProMix种植后的前9天。在天 10，用Spot Sprayer或喷壶开始给植物3天和1x Peters Excel 13-2-13 150ppm氮（pH 6.1）。
3. 如果需要限制性枝条生长，植物的顶部高于第二三叶（约在第15天）可能被切断。使用不锈钢已用酒精或抗菌皂清洁的剪刀。这个时间段将随季节和生长条件而变化。在夏季，可能需要两次浇头。植物在温室中在自然光下生长，每天补充12 h：12h光：人造光的暗循环。温室气温保持在25℃（天）和14℃（夜），20-50％湿度。

通过检查大豆根和修剪未转化的根来评估转化
1. 在第38天，（图5）轻轻地从所有植物中去除土壤每个克隆组通过将它们置于4加仑可高压灭菌的桶中。轻轻按摩根块，以删除Promix。用房间冲洗根 ?温度水。一个桶可以用来洗约50棵植物。将去污的植物储存在含有0.5x Peters的2加仑桶中 Excel 13-2-13 75ppm氮（pH6.1）
  
  图。 5.大豆植物在温室中，并在转化后
  38天生长良好
2. 在黑暗的房间，使用Dark Reader Spot Lamp-SL85和橙色过滤器 ?眼镜以可视化GFP根（图6）。丢弃没有植物 GFP根。识别20个或更多最好的复合植物与好 GFP根进行实验。转化效率范围从 65至90％。
3. 用剪刀，剪掉非GFP根上复合材料厂。在温室中保持复合植物它们的根在约75ppm处浸没在0.5x Peters Excel 13-2-13中氮（pH6.1）两天，以便在它们之后最小化萎。 ?在沙子中重新种植
  
  图6.暴露于暗光的大豆根以显现表达GFP的根
4. 植物复合植物在淹没，无菌砂中帮助他们从去除非GFP根中恢复。每个2厘米的砂细胞。将植物的根部放在细胞中，与其基部幼苗低于细胞顶部1cm。轻轻地洒湿沙 ?并在根的顶部。建立一个紧凑的2至3厘米高的砂锥围绕幼苗的基部以保持其直立。将单元格放在平面。用0.5x Peters Excel 13-2-13 75ppm氮气冲洗平板。离开植物在洪水沙子2天。
5. 将植物转移到含有约2.5厘米深的湿Promix的穿孔平面。让植物过夜。
6. 第二天，接种线虫注意：如果小植株在非GFP根后出现枯萎切除，将它们遮蔽，以保护他们免受阳光直射他们已经恢复。

食谱

MS媒体

准备
1升

MS盐
4.4克

3％蔗糖 30克

将pH调节至5.7
如果要在一天内使用MS培养基，则无需高压灭菌。

可怕的肉汤，修改
RPI预混巧克力肉汤

Terrific Broth预混料的内容	1升
酪蛋白消化蛋白胨	12 g/L
酵母提取物	24克/升
磷酸二钾（K 2 HPO 4）	9.4克/升
磷酸钾（K 3 PO 4）	2.2 g/L
准备	1升
将TB预混物加入1L水中	47.6克
甘油	4 ml

无需pH介质
高压灭菌器20分钟

Scotts Peters Excel 13-2-13 16x肥料
用13粒KOH制备1加仑水
将每种溶液很好地混合
用10汤匙准备1加仑的水[10T] Peters Excel13-2-13，Scotts Peters Excel 13-2-13 32x
Mix合并两种溶液并分别混匀
pH 6.2

致谢

该协议改编自我们以前的工作，包括（Matthews等人，2013; 2014和Youssef等人，2013）。我们感谢猎人胡子的技术支持。提及商业名称，专利产品或供应商不构成美国农业部对产品的担保或保证，也不意味着批准其他可能适用的其他产品或供应商。作者没有利益冲突。

参考文献

Matthews，B.F.，Beard，H.，Brewer，E.，Kabir，S.，MacDonald，M.H.and Youssef，R.M。（2014）。拟南芥基因，AtNPR1，AtTGA2和AtPR-5，赋予部分抗性当在转基因大豆根中过表达时，大豆胞囊线虫（ Heterodera glycines ）。

Matthews，B.F.，Beard，H.，MacDonald，M.H.，Kabir，S.，Youssef，R.M.，Hosseini，P.and Brewer，E。通过对大豆中100种基因对其主要病原体，大豆胞囊的功能代谢研究的工程化抗性和过敏性线虫。 237（5）：1337-1357。

Youssef，R.M.，MacDonald，M.H.，Brewer，E.P.，Bauchan，G.R.，Kim，K.H。和Matthews，B.F。（2013）。 AtPAD4的异位表达拓宽了大豆对大豆胞囊和根结线虫的抗性。 BMC Plant Biol 13：67.