材料和试剂

5ml Rimless Kahn培养管（12×75mm）（Corning，目录号：9820-12）
闪烁瓶（Sigma-Aldrich，目录号：Z190527）
酶和底物作为来自匀浆细胞或组织的蛋白质匀浆获得（参见步骤的步骤1）
Bio-Rad蛋白测定染料试剂浓缩物（Bio-Rad Laboratories，AbD Serotec ，目录号：5000006）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
D - （+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
[γsup 32 P] ATP（PerkinElmer，目录号：BLU002001MC）
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：C2432）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
三氯乙酸（TCA）（Sigma-Aldrich，目录号：T6399）
磷钨酸（PTA）（Sigma-Aldrich，目录号：P4006）
非水液体闪烁鸡尾酒（PerkinElmer，目录号：1200-434）
缓冲HEPES（参见配方）
反应缓冲液（参见配方）
TCA-PTA 10-1（％w/v）（参见配方）
TCA-PTA 5-0.5（％w/v）（参见配方）
载体脑匀浆（见配方）

设备

Tip Sonicator（Branson Sonic Power Company，型号：Sonifier B-12）或ULTRA-TURRAX
分光光度计（使用波长：595nm）（Shimadzu Scientific Instruments，型号：BioSpec-mini）
Vortex（IKA VORTEX 3）（Sigma-Aldrich，目录号：Z654779）
移液管（PIPETMAN L Starter Kit）（Gilson，目录号：F167350）
离心机（Cavourargetina，型号：VT-3216Dx24）
水恒温槽（Vicking，型号：Masson D）
闪烁计数器（WinSpectral，Wallac，PerkinElmer）
根据每个国家的法律，实验室准备了用于安全接收，储存，处理和处理放射性物质的所有必要设备。
盖革计数器（Ludlum Measurements，型号：3测量仪）

程序

注意：为了确定在何种条件下脂质合成随时间线性，制备不同的管并在37℃进行不同时间的反应。如果您正在评估改变给定蛋白质的脂质合成的能力，您还必须确定脂质合成与感兴趣的蛋白质的浓度成线性关系。
根据规则和管辖法律，进行实验的人员必须接受严格的放射性工作培训。

将放射性32 P掺入细胞/组织匀浆中
1. 用所需的培养基在10cm培养皿上生长所需的细胞系，直到达到90％汇合。
  注意：在这一点上，如果你需要你的细胞培养特殊情况或经过特殊治疗，您应该满足您的需求的协议。
2. 收获细胞与300 μlmilliQ水或使用匀浆器或ULTRA-TURRAX ^?，如果样品从组织获得，以获得蛋白质匀浆到实验要求
3. 在冰上超声，并使用Bradford方法或类似方法测量总蛋白浓度。
4. 始终在冰上保持样品。
5. 准备反应管。每个都必须包含最终卷 ?用1×反应缓冲液，3μCi的[γ-32 P] ATP和蛋白质浓度为1.25mg/ml。考虑必须测量样品至少一式三份。为此，首先在Kahn管中等分达到所需蛋白质所需的蛋白质匀浆的量浓度。然后，加入足够体积的反应缓冲液和 ?[γsup 32 P] ATP以达到上述浓度。正常 ?有几个条件需要测量，并考虑到他们必须至少执行一式三份，我们找到它方便准备所有管的主混合物，以避免移液错误。为此，首先将蛋白质匀浆在等分试样中不同的管，然后准备具有足够量的主混合物反应缓冲液和[γ-32 P] ATP并将其等分在管中。最后，用milliQ水达到最终体积。
  注意：为了简化，它将有助于正常化所有样品的蛋白质浓度待添加的主混合物的体积对于所有管是相同的。此外，准备比主混音更大的音量理论要求，补偿小体积损失或移液管校准。使用milliQ水调整最终体积。
6. 涡旋10秒。
7. 在37℃下进行反应60分钟。
  注意：这时你可以通过冻结或你可以停止反应继续纯化步骤。如果你停止反应冷冻，样品必须放在沙坑中避免照射，根据放射性物质的工作条件。
8. 添加80 ?μlTCA-PTA 10-1（％w/v）以沉淀脂质和蛋白质。在这点，你应该开始看到即将形成的白色沉淀。涡旋10秒，并以3500rpm离心10分钟。
脂质沉淀和纯化
1. 弃去上清液，其含有没有的游离的[γ^{32 P] ATP ?并且涡旋，直到沉淀物被解聚。}
2. 加入1ml TCA-PTA 5-0.5（％w/v）并再次涡旋10秒。离心并重复沉淀洗涤四次。丢弃每轮后的上清液注意：如果沉淀的量是太小，你可以加入5微升脑匀浆，这将作为一个 ?载体（见图2）。
  
  图2. 预期金额的示例 ?沉淀（右管）后加入载体脑匀浆。 ?左边的管显示出沉淀物太小。
3. 用milliQ水进行最终洗涤，以有利于脂质在有机溶剂中溶解（步骤B12）。
4. 离心后，弃去最后一次洗涤的水上清液并涡旋，直到沉淀物解聚
5. 加入1.5ml氯仿：甲醇2:1，涡旋10秒。的氯仿溶解脂质，甲醇维持蛋白质沉淀
6. 在3,500rpm离心10分钟，以允许蛋白质沉淀和从可溶性脂质中分离。
7. 转移1.3毫升含有标记的脂质的上清液 ?并在90℃水浴中干燥3小时或在室温下干燥过夜。当转移上清液时，要小心，不要拉 ?沉淀的蛋白质，其可以用^{P标记。
  警告：As 该步骤包括转移含氯仿的溶液，应使用预先用氯仿平衡过的玻璃吸管 ?避免样品损失。
  注意：转移时损失0.2 ml 避免上清液干扰沉淀。}
测量纯化脂质中的^{P含量加入1ml非水闪烁鸡尾酒，轻敲并涡旋10秒。

使用a确定脂质中掺入的32 P的水平液闪烁计数器。反应必须在中进行一式三份，最小。}
数据分析
1. 结果可以表示为绝对值（如图3所示）或作为相对于作为100％的控制条件的相对值纳入。

代表数据

图3是指示预期结果的类型的数据的代表性示例。在这种情况下，实验条件测量在c-Fos蛋白，其磷酸化形式或其突变体存在下的磷脂合成量。在这方面，结果表示为磷脂标记的量（Ferrero等人，2012）。

图3.通过c-Src磷酸化的c-Fos不激活磷脂合成。通过纯化的c-Src（Pc-Fos）磷酸化重组c-Fos，c-Fos的磷脂合成的活性，如先前所述（Gil等人，2004）检查c-Fos的磷酸模拟Y10/30E突变体和c-Fos Y10/30F的不可磷酸化突变体。在37℃下孵育60分钟。如先前所述进行P-磷脂定量（Guido和Caputto，1990）。结果表示为c.p.m。的掺入磷脂/mg蛋白质的平均值±s.d。的三个实验重复三次; *通过单向ANOVA分析确定的相对于对照（缓冲液）的P <0.002。 Y10/30F不与未加任何底物孵育的c-Src和c-Src一起作为对照。注意，在测定中c-Src的存在不改变磷脂合成。

笔记

如果在进行步骤A6中的反应之后决定冷冻，则不添加TCA-PTA 10-1（％w/v）溶液，因为匀浆可能聚集并与未掺入的[γ P] ATP分子，这可能导致错误的测量。

食谱

缓冲液HEPES（2M，pH7.5）将476.6g HEPES溶解在800ml H 2 O中用适当体积的浓NaOH将pH调节至7.5 将H sub 2 O添加到1L的最终体积中。

反应缓冲液（20x，20ml）

试剂	数量	集中
NaCl	3.2726 g	2,800 mM
KCl	0.1491克	100 mM
MgCl 2	0.019克	10 mM
葡萄糖	0.4036克	112 mM
HEPES缓冲液（2M，pH7.5）	12.8 ml

加入milliQ水至最终体积为20ml ml 如果储存在-20℃，缓冲液可稳定6个月。

TCA-PTA 10-1（％w/v）
重量10克TCA和1克PTA，并加入milliQ水至终体积为100ml
TCA-PTA 5-0.5（％w/v）
等分50ml TCA-PTA 10-1，加milliQ水至终体积为100ml。
载体脑匀浆
安乐死成年Wistar老鼠和消除大脑
称重并制备1g组织/ml milliQ水的匀浆

致谢

我们感谢Beatriz L. Caputto博士有益的讨论，以适应和修改她以前的工作的协议（Guido和Caputto，1990）。我们也感谢CONICET和FONCYT的资金。

参考文献

Guido，M.E。和Caputto，B.L。（1990）。在暴露于光照或黑暗的鸡中对视网膜和视神经磷脂的标记。 J Neurochem 55（6）：1855-1860。
Ferrero，G.O.，Renner，M.L.，Gil，G.A.，Rodriguez-Berdini，L.and Caputto，B.L。（2014）。 c-Fos激活的核磷脂酰肌醇4,5-二磷酸酯[PtdIns（4,5） P（2）]促进全球转录变化。 Biochem J 461（3）：521-530。
Ferrero，G.O.，Velazquez，F.N.和Caputto，B.L。（2012）。激酶c-Src和磷酸酶TC45协调调节c-Fos酪氨酸磷酸化和c-Fos磷脂合成激活能力。 Oncogene 31（28）：3381-3391。