材料和试剂

1.5 ml微量离心管
0.2μM尼龙过滤器（Sigma-Aldrich，目录号：Z259969）
100毫升玻璃注射器
移液管头
新鲜拟南芥组织（要测试的任何植物部分，50-100mg就足够了）
L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：778672）
γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-Glu-Cys）（Sigma-Aldrich，目录号：G0903）
L谷胱甘肽还原（Sigma-Aldrich，目录号：G4251）
双蒸水（由中国科学技术大学生命科学学院提供）
双蒸水
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：435570）（参见Recipes）
2-（N-吗啉代）乙磺酸水合物（MES）（Sigma-Aldrich目录号：M8250）（参见配方）
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA 2Na 2H O）（Sangon Biotech，目录号：A100105） br />
单溴甲烷（mBBr）（Sigma-Aldrich，目录号：69898）（参见配方）
三氟乙酸（TFA）（Sigma-Aldrich，目录号：302031）（参见Recipes）
乙腈（OCEANPAK，目录号：Ac00030281）（参见配方）

设备

分析天平（Mettler-Toledo International Inc.，型号：ML104）
砂浆和杵
冷冻微量离心机（Thermo Fisher Scientific，Eppendorf，型号：5424R）
37℃培养箱（上海景洪实验室仪器，型号：GNP-9080）
反相C18柱（5μm，110A，150 x 4.6 mm）（Phenomenex，型号：Gemini C18柱）或同等级，保护柱（Phenomenex，SecurityGuard Standard，型号：AJ0-7597）
HPLC设备（Agilent Technologies，型号：1200系列）
1. 泵（Agilent Technologies，型号：G1312A）
2. 采样器（Agilent Technologies，型号：G1328A）
3. 柱加热器（Agilent Technologies，型号：G1316A）
4. FLD检测器（Agilent Technologies，型号：G1321A）
200μl移液器
pH计（Thermo Fisher Scientific，Mettler Toledo，型号：FE20-FiveEasy Plus ^TM）
超声波清洗机（上海松士超声波仪器，型号：DS-2510DT）

软件

合适的数据收集和处理软件（Agilent Technologies，型号：1200化学工作站）
标准曲线绘图（Microsoft Excel）

程序

样品和标准品的制备
1. 将新鲜组织取样到1.5ml微量离心管中并称重 ?与分析天平。 50-100mg对于每种生物学是足够的 ?样品
2. 样品在微量离心管中用a研磨研钵和杵用2体积的0.15M HCl通过200μl移液管加入 ?（例如，100毫克组织需要200微升）
3. 匀浆在12,000×g，4℃下离心15分钟，并且上清液转移到新的1.5ml微量离心管中。这一步可以如果需要重复，以除去不溶性物质。
4. 准备10 ?mM L-半胱氨酸，γ-谷氨酰半胱氨酸的储备溶液谷胱甘肽，然后制备以下标准：0，50，100，200， 500μM，1000μM的L-半胱氨酸，γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽用0.15M HCl稀释储备液。
5. 100μl上清液从步骤A3（或标准品）转移至1.5ml微量离心机含有2μl0.5M EDTA，2.6μl300mM mBBr的管，乙腈和100μl的1.75M MES（pH 7.4）。混合物在黑暗中在37℃孵育1小时以允许衍生化反应完成。
6. 将混合物如步骤A3中离心5分钟，然后定量

HPLC定量（参见Agilent 1200 HPLC化学工作站操作）
从"方法"菜单中选择"编辑整个方法"，并根据以下文本设置参数。为了定量，将来自步骤A6的50μl样品注入HPLC系统的样品室中，并使用反相C18柱并在Agilent 1200 HPLC系统上以0.8ml/min的流速分离。溶剂A和B用于以如下表所示的梯度洗脱荧光衍生物。使用荧光检测器检测荧光衍生物（mBSR），激发波长为260nm，发射波长为474nm。

表1. HPLC洗脱程序

时间（分）	A（％）	B（％）	流速（ml/min）
0.0	90	10	0.8
0.3	85	15	0.8
14.0	80	20	0.8
15.0	0	100	0.8
19.0	0	100	0.8
20.0	90	10	0.8
24.0	90	10	0.8

使用上述HPLC程序分析标准品和样品，至少重复3次。
使用ChemStation软件对峰面积进行积分。
从"查看"菜单中选择"数据分析"，进入图像数据分析。
从"文件"菜单中选择"加载信号"以选择数据文件。
从"积分"菜单中选择"积分"，然后积分数据。

计算
1. 通过绘制标准曲线的浓度（μM）标准（Y轴）峰值区域（X轴）并添加趋势线。
2. 确定每个样品的峰面积并确定浓度使用趋势线。浓度（μM）= a *峰面积+ b（a和b是 ?已在趋势线中计算）。

食谱

0.15 M HCl（在室温下储存）
1.27ml HCl（37％） 100ml双蒸水
使用100ml注射器通过0.2μM尼龙过滤器过滤
1.75 M MES（pH 7.4）（储存在4℃） 3.41克MES
10ml双蒸水
使用NaOH调节pH至7.4，并使用100ml注射器通过0.2μM尼龙过滤器过滤
0.5M EDTA 2Na 2H 2 O（在室温下储存）
18.6g EDTA。 2Na 2H 2 O 溶解在双蒸水中，用NaOH调节pH至8.0，体积达到100ml，
使用100ml注射器通过0.2μM尼龙过滤器过滤
300mM单溴甲烷（储存在-20℃）
0.025g单溴甲烷 307.3μl乙腈
12,000×g ，4℃，30分钟以除去不溶物质
溶剂A：0.1％（v/v）三氟乙酸（HPLC级）（新鲜制备） 1ml三氟乙酸 999 ml双蒸水
使用100ml注射器通过0.2μM尼龙过滤器过滤
溶剂B：90％（v/v）乙腈（HPLC级）（新鲜制备） 900ml 100％乙腈 100ml 0.1％（v/v）三氟乙酸使用100ml注射器通过0.2μM尼龙过滤器过滤溶剂A和溶剂B需要在超声波清洗器中脱气30分钟，具有松开的盖子
10mM L-半胱氨酸（储存在-20℃） 0.0606g L-半胱氨酸 50ml 0.15M HCl
10mMγ-谷氨酰半胱氨酸（保存在-20℃） 0.1251gγ-谷氨酰半胱氨酸 50ml 0.15M HCl
10mM谷胱甘肽（保存在-20℃） 0.1537克谷胱甘肽 50ml 0.15M HCl

标准（储存于-20°C）

	0μM	50μM	100μM	200μM	500μM	1,000μM
10 mM	0微升	5微升	10微升	20微升	50微升	100微升
0.15 M HCl	1000微升	995微升	990微升	980μl	950微升	900μl

致谢

该协议从Fahey和Newton（1987）描述的先前工作修改。

参考文献

Fahey，R.C。和Newton，G.L。（1987）。使用单溴甲烷荧光标记和高效液相色谱法测定低分子量硫醇。 Methods Enzymol 143：85-96。
Wang，Z.，Mao，J.L.，Zhao，Y.J.，Li，C.Y.and Xiang，C.B。（2015）。 L-半胱氨酸通过植物拟南芥中的生长素/PLETHORA和SCR/SHR途径抑制根伸长。 J Integr Plant Biol 57（2）：186-197。
Xiang，C。和Oliver，D.J。（1998）。谷胱甘肽代谢基因协调应答拟南芥中的重金属和茉莉酸。植物细胞 10（9）：1539-1550。
Zhao，Q.，Wu，Y.，Gao，L.，Ma，J.，Li，C.Y.and Xiang，C.B。（2014）。硫营养素可??用性通过影响根吲哚-3-乙酸水平和干细胞生态位来调节根伸长。 Integral Plant Biol 56（12）：1151-1163。