材料和试剂

pH指示剂纸（pH 1-14）（Merck Millipore Corporation，目录号：1109620003）
一次性PD-10脱盐柱（VWR International，目录号：95017001）
Whatman 定性滤纸，1级（Sigma-Aldrich，目录号：WHA1001110）
安全锁管2ml（Thermo Fisher Scientific，Eppendorf，目录号：3706）
15ml离心管（Sigma-Aldrich，目录号：CLS430790）中。
50ml的离心管（Sigma-Aldrich，目录号：CLS430290）中。
注意：可用性目前不可用。
Nunc 96孔微孔板（无盖和平底孔）（Thermo Fisher Scientific，目录号：269787）
石蜡膜（Bemis软包装）
乙酸钠三水合物（CH 3 COONa 3+ 3H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：S8625-250G）
叠氮化钠（NaN 3）（Sigma-Aldrich，目录号：71290-100g）
来自里氏木霉ATCC 26291（Sigma-Aldrich，目录号：C2730）的纤维素酶
来自里氏木霉（Genencor，DuPont）的Accellerase ^? BG
D-葡萄糖（C 6 H 12 SO 6）（Sigma-Aldrich，目录号：G8270-1kg）。
来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶（Sigma-Aldrich，目录号：G6125-50KU）
来自辣根的辣根过氧化物酶（Roche Diagnostics，目录号：10814407001）
2,2'-联氮基 - 双（3??-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）（Roche Diagnostics，目录号：11112422001）
盐酸发烟37％（Merck Millipore Corporation，目录号：1003171000）
用于分析的氢氧化钠丸（Merck Millipore Corporation，目录号：1064981000）
乙醇（Merck Millipore Corporation，目录号：1009901001）
丙酮（Merck Millipore Corporation，目录号：1000121000）
冰醋酸（Merck Millipore Corporation，目录号：1000631000）
MilliQ水
0.1M乙酸缓冲溶液（pH4.5）（参见配方）
0.1M乙酸缓冲溶液（pH 4.8）（参见配方）
葡萄糖氧化酶（GOD） - 过氧化物酶（POD）溶液（参见配方）

设备

平衡（Mettler Toledo，型号：XP-105 Delta Range）
Thermoblock（Thermo Fisher Scientific，Eppendorf，型号：Thermomixer Compact）
温度控制的台式微量离心机（Thermo Fisher Scientific，Eppendorf，型号：5417R）
温度控制微孔板分光光度计（Molecular Devices，型号：Spectra Max 250）
耐酸Centrivap离心真空浓缩机（Labconco，目录号：7810016）
烤箱在37°C
夹具和结扣三脚架（VWR International，目录号：2410093和2410258）
100ml容量瓶（Duran Group，目录号：246712556）
用于微测试板的密封膜（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：EN76.1）
微量离心机（LabSource，VWR International，目录号：37001298）

程序

准备酶混合物
1. 在该方案中使用的酶混合物是纤维素酶和纤维素酶的混合物 β-葡糖苷酶（BG）。这些酶首先需要从他们的清除稳定盐。这是用脱盐Econo-Pac 10 DG柱， ?装有Bio-gel P-6DG凝胶，并且可以用于纤维素酶和 BG。
2. 首先通过倾倒去除防止真菌在柱上生长的NaN 3+溶液。
3. 在柱上加入20ml乙酸缓冲液（pH 4.8），让重力作用
4. 混合1毫升酶（纤维素酶或BG）与2毫升乙酸缓冲液溶液（pH 4.8）在Corning 15ml离心管中。把这个混合 ?列，并让它运行通过列。取出3毫升离开列。
5. 加入4ml乙酸缓冲液（pH 4.8）在柱上，收集从柱上离开的4ml Corning ^？ 15ml离心管。这是脱盐酶。
6. 通过运行100毫升milliQ水通过柱清洁柱。的洗涤柱可再次用于另一次脱盐
7. 关上柱，并用0.02％NaN 3填充柱。关上柱顶部带有盖子，并将柱子保存在室温下
8. 当纤维素酶和BG都脱盐时，用乙酸缓冲溶液（pH 4.8）将脱盐BG稀释350倍。
9. 将脱盐纤维素酶和脱盐，稀释的BG以5：3的比例混合
10. 用乙酸缓冲液（pH 4.8）稀释该混合物10倍。这是将在糖化中使用的酶混合物测定。建议酶混合物在两个内使用制备后数月。
准备GOD-POD溶液（Bergmeyer，1974）和校准曲线
葡萄糖氧化酶（GOD） - 过氧化物酶（POD）方法间接测量葡萄糖的浓度（图1）。在第一步中，GOD将葡萄糖单体转化为葡萄糖酸，同时产生过氧化氢。过氧化氢的氧化能力被POD用于氧化染料2,2'-连氮基 - 双（3??-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）。最后，这种氧化形式的ABTS将在405nm的波长处吸收

图1.用于测量葡萄糖的反应机制示意图
1. 如配方中所述制备100毫升GOD-POD溶液。 GOD-POD 溶液含有50mg ABTS，44.81mg葡萄糖氧化酶和173μl4％过氧化物酶。通过加入乙酸将最终体积调节至100ml ?缓冲液（pH4.5）
2. 制作不同的稀释系列葡萄糖浓度（从20μM至200μM）。按照中描述操作 ?部分H，绘图如图2所示
  
  图2.校准曲线示例
测量酶活性
对于糖化结果的公布，建议报告酶活性。因此，可以在完全相同的条件下重复糖化测定。此外，由于实际原因，在一个单一测定中可以分析的样品数量受到限制。为了比较在不同糖化测定中获得的糖化结果，有必要用相同的酶活性进行这些测定。
1. 用4.5mg Whatmann滤纸填充三个安全锁管。也包括空白，即一个没有滤纸的安全锁管。
2. 加到每个安全锁管（有或没有滤纸）450μl乙酸缓冲溶液（pH4.8）和50μl酶混合物
3. 在设置在50℃的热块中孵育恰好1小时，同时在12.5Hz下摇动
4. 煮沸样品并在99℃下空白5分钟，无振荡。
5. 以23,477×g离心5分钟。
6. 用乙酸缓冲液（pH 4.8）稀释上清液20次
7. 使用葡萄糖测量稀释的上清液中的葡萄糖释放 ?氧化酶 - 过氧化物酶（GOD-POD）（见H部分）并计算活性 ?的酶混合物[以滤纸单位（FPU）/ml表示] 根据Xiao等人（2004）和as所述的公式如图3所示。
  
  图3.酶活性计算的实例
酸预处理（见注1）
1. 称重10mg等分的生物质。生物质可以切碎成少片段，例如2毫米长的拟南芥茎段，或者生物量可以是 ?研磨，例如杨树茎。
2. 加入1ml 1M HCl，并在80℃下振荡2小时，同时以12.5Hz振荡
3. 在23,477×g离心5分钟，除去上清液
4. 洗涤沉淀三次，每次加入1ml milliQ-水，在23,477×g离心5分钟，除去上清液。
  注1：可能有许多不同的预处理。广阔类别是碱或酸或热水。也可以进行预处理跳过。最佳类型的预处理是依情况而定的。一个碱预处理具有破坏部分木质素的特性和酯键，而酸预处理将主要分解半纤维素和无定形纤维素中的糖苷键
碱性预处理
1. 称重10mg等分的生物质。生物质可以切碎成少片段，例如2毫米长的拟南芥茎段，或者生物量可以是 ?研磨，例如杨树茎。
2. 加入1ml 62.5mM NaOH，如Van Acker等人（2014）中所述，并在90℃下孵育3小时，同时以12.5Hz振动。
3. 在23,477×g离心5分钟，除去上清液
4. 洗涤沉淀三次，每次加入1ml milliQ-水，在23,477×g离心5分钟，除去上清液。
严重洗涤步骤
该洗涤步骤除去在预处理期间使用的残留化学品，但也除去不是细胞壁的一部分的游离糖和其它溶质。因此，对于不经任何预处理而糖化的样品，也应包括该步骤
1. 加入1ml的70％乙醇，并在55℃下孵育过夜
2. 在23,477×g离心5分钟，除去上清液。
3. 通过加入每次1毫升70％乙醇洗涤沉淀树次，在23,477×g离心5分钟并除去上清液
4. 最后用1ml丙酮洗涤沉淀，在23,477×g离心5分钟，除去上清液。
5. 使用真空浓缩器干燥沉淀。
6. 称量剩余生物量。
糖化（见注2）
1. 将每个干燥（预处理或未处理）样品溶解在1ml乙酸中缓冲液（pH4.8）中，在50℃下振荡（12.5Hz）孵育
2. 孵育5分钟后，向每个样品中加入100μl酶混合物
3. 在几个时间点，例如在添加后2小时，6小时，24小时，48小时酶混合物，在旋转后取上清液的20μl等分试样在台式微量离心机中下移样品
4. 稀释这20 以适当的方式（即在10至40倍的范围内）稀释）与乙酸缓冲溶液（pH 4.8）并煮沸稀释 ?溶液在99℃下5分钟以终止酶反应
5. 根据步骤H测量葡萄糖浓度。
  注意2：为了非常精确地工作，建议只处理2 样品每分钟。这意味着向前两个样品中加入酶在第一分钟，在第二个中向接下来的两个样品添加酶 ?分钟等。在完全孵育一定时间后， 2小时， ?首先将两个样品离心，并在第一个样品中取出等分试样分钟。将样品煮沸以终止反应。在第二分钟，将两个下一个样品离心，取出等分试样并煮沸停止反应等。
测量释放的葡萄糖
1. 对于每个样品（得自步骤G），标准葡萄糖浓度（参见步骤B）或酶活性测量（参见步骤C），转移50μl ?加入96孔平底微孔板的单独孔中。所有测量一式三份进行。
2. 用空白填充至少3个孔，即， 50μl乙酸缓冲液（pH 4.8）。还向这些空白中加入150μlGOD-POD溶液
3. 向每个孔中加入150μlGOD-POD-溶液
4. 用密封膜关闭微孔板，将微量滴定板在37℃的烘箱中孵育正好30分钟。
5. 轻轻取出密封膜，用平板分光光度计读取405nm处的吸光度
6. 使用GOD-POD校准曲线（见步骤B）计算样品中的葡萄糖浓度（见注3，4和5）。
  注意3：对于计算，还要考虑稀释因子和不同时间点的起始体积。
  注意4：图4显示了糖化结果的示例。
  1. 图4. WT的糖化结果的实例（蓝色菱形和线）和木质素缺陷型拟南芥（红色） ?正方形和线条）
    
    注释5：通常将释放的葡萄糖归一化为理论值如果纤维素完全地将被回收的葡萄糖的量糖化。因此，纤维素 - 葡萄糖转化可以是计算。为了测定小样品中的纤维素含量，可以遵循由Foster和同事4描述的方案。一个纤维素的脱水葡萄糖单元（162.14g/mol）产生葡萄糖（180.155g/mol）糖化。因此，理论上完全转化1mg纤维素将产生1.11mg 葡萄糖。

食谱

0.1M乙酸缓冲溶液（pH4.5）如下制备pH4.5的乙酸缓冲液：
32.5ml 1M冰醋酸
2.38g三水合乙酸钠 967.5ml milliQ-水
0.1M乙酸缓冲溶液（pH 4.8）如下制备pH 4.8的乙酸缓冲液：
24.1ml 1M冰醋酸 3.52g三水合乙酸钠 975.9ml milliQ-水
GOD-POD解决方案（见注6）
准备GOD-POD解决方案如下：
50 mg（= 1片）ABTS
44.81mg葡萄糖氧化酶
173μl4％过氧化物酶（见注7）
加入以使用0.1M乙酸缓冲液（pH4.5）达到总体积为100ml 注释6：首先将一个ABTS片剂溶解在100ml的容量瓶中 ?在约40ml的0.1M乙酸缓冲液（pH 4.5）中。一旦是溶解并加入葡萄糖氧化酶和过氧化物酶，调节体积用0.1M乙酸缓冲液（pH4.5）标记为100ml 注释7：4％过氧化物酶= 20mg过氧化物酶溶于500μl0.1M乙酸缓冲液（pH4.5）中。

致谢

这项工作得到了根特大学多学科研究伙伴关系"生物技术促进可持续经济"，欧洲委员会通过第七框架计划RENEWALL（KBBE-2007-3-1-01）和MultiBioPro赠款协议N°311804）和科学技术创新局（IWT）。 RV负责研究基金会佛兰德斯（FWO）的博士后研究。

参考文献

Bergmeyer，H.U。（1974）。酶法分析方法。学术出版社。
Foster，C.E.，Martin，T.M.and Pauly，M。（2010）。植物细胞壁（木质纤维素生物质）的综合组成分析第二部分：碳水化合物。 em> J Vis Exp （37）。
Van Acker，R.，Leple，JC，Aerts，D.，Storme，V.，Goeminne，G.，Ivens，B.，Legee，F.，Lapierre，C.，Piens，K.，Van Montagu，MC， Santoro，N.，Foster，CE，Ralph，J.，Soetaert，W.，Pilate，G.and Boerjan，W。（2014）。改善了从缺乏肉桂酰辅酶A还原酶的田间生长的转基因杨树中的糖化和乙醇产量。 Proc Natl Acad Sci USA 111（2）：845-850。
Van Acker，R.，Vanholme，R.，Storme，V.，Mortimer，J.C.，Dupree，P.and Boerjan，W。（2013）。木质素生物合成扰动影响拟南芥中的次生细胞壁组成和糖化产量。 Biotechnol Biofuels 6（1）：46。
Xiao，Z.，Storms，R。和Tsang，A。（2004）。基于微孔板的滤纸测定法，用于测量总纤维素酶活性。 Biotechnol Bioeng 88（7）：832-837。