材料和试剂

尼龙网（300μm网孔）（NBC Meshtec，型号：NMG 58或类似类型）
9cm×9cm正方形培养皿（Simport，目录号：D210-16）
塑料框架[外尺寸，10厘米（W）×12厘米（H）×1.5厘米（D）;窗口尺寸，7.5cm（W）×9cm（H）]]
塑料容器[13厘米（宽）x 13厘米（H）x 3厘米（D）] - 应该是透明的，没有颜色
双面胶带（NICHIBAN，型号：NW-10或类似类型）
单面胶带（Shamrock Scientific Specialty Systems，型号：ST-12-1或类似类型）
纸巾（NIPPON PAPER INDUSTRIES CO。，目录号：37016或类似类型）
闪烁瓶（Sigma-Aldrich，目录号：Z190527或类似类型）
拟南芥（ Arabidopsis thaliana ）的种子
无菌去离子水
琼脂（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：016-11875或适于植物生长的类似类型）
用于拟南芥幼苗生长的无菌琼脂培养基[通用营养培养基可以使用。可以根据研究目的修改营养来源和浓度，例如硫酸盐浓度调整为1,500μM或15μM硫酸盐（Maruyama-Nakashita等人，2015）]
用于标记和后标记培养的无菌液体培养基（营养源和浓度与上述琼脂培养基相同）
（美国放射性标记的化学品，目录号：ARS0105）的10mCi/ml（370MBq/ml）的水溶液中， br />
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：H1758）
Ultima Gold TM sup/TM闪烁混合物（PerkinElmer，目录号：6013321）

设备

生长室（NK系统，型号：LPH-241SP或类似类型，根据研究目的适当地设置生长条件，例如22℃，16小时光照/8小时黑暗循环）
高压灭菌器（TOMY SEIKO CO。，型号：LSX-500或类似型号）
机械移液器（Gilson，型号：P-200和P-1000）和尖端
分析天平（可读性，0.1mg）（Cole-Parmer Instrument Company，Mettler Toledo，型号：MS204TS或类似类型）
振动器（往复振动器或旋转振动器）（TAITEC CORPORATION。，型号：NR-10或类似类型）
液体闪烁计数器（Hitachi Aloka Medical，型号：AccuFLEX LSC-7400或类似类型）
公用刀（KOKUYO，型号：HA-S200YR或类似类型）
不锈钢钳（Sigma-Aldrich，目录号：Z168696或类似类型）
外科剪刀（不锈钢解剖剪）（Sigma-Aldrich，目录号：Z265977或类似类型）

程序

网状包埋的琼脂培养基的制备
1. 将尼龙网（300μm开口）切成1 cm x 8.7 cm的条。包装尼龙网条紧紧地放在铝箔中，高压灭菌让它们干燥。保持尼龙网在铝箔扁平化期间高压灭菌和干燥过程
2. 准备琼脂培养基，其上您在9cm×9cm正方形培养皿中生长拟南芥幼苗。的琼脂浓度应为0.8％或更高以保持根部保持 ?介质的表面
3. 嵌入高压灭菌的尼龙网垂直地放入固化的琼脂培养基中。插入长边在该位置垂直地抵靠琼脂培养基的表面离培养皿的一侧约2cm（图1A）。大约一半的网格应该被包埋在琼脂中中。结果，将每种琼脂培养基分成2cm×9cm 和7cm×9cm面积的尼龙网（图1B）
4. 填写尼龙网的上侧与琼脂培养基之间的间隙 ?cm×9cm面积，通过使用a。注入微量的熔化的琼脂培养基机械移液管（图1C-D）。在室温下固化琼脂培养基温度。
拟南芥幼苗的垂直平板培养
1. 按照标准方案杀死拟南芥种子的表面 ?（Li，2011）或其他地方描述的类似方法。浸泡种子 ?无菌去离子水中在4℃下暗处3天以上，以增强发芽
2. 将表面灭菌的种子放在嵌入式琼脂培养基中，离开大约2mm ?尼龙网在2厘米×9厘米区域。不要在每个附近播种种子侧的培养皿（图1E）
3. 设置琼脂平板垂直地在生长室中并在a下生长拟南芥幼苗控制条件。拟南芥的根将穿透尼龙网，并在琼脂培养基的表面伸长（图 1F）。如果根没有附着在培养基的表面上穿透尼龙网，轻轻地将这些根表面的培养基使用无菌吸头或镊子。
4. 在生长室中孵育适当的时间段后（例如10-15天，这通常是适当的时间以获得幼苗的大小适合分析，适用于野生型植物生长在标准营养培养基上），你将获得一条尼龙用于^{S标记的拟南芥苗实验
  
  图1.网状嵌入琼脂的示意图用于拟南芥幼苗的垂直平板培养的培养基。 A.插入 ?将高压灭菌网放入琼脂培养基中。 B.网状包埋的琼脂培养基。 C.填充网格的上侧和琼脂之间的间隙通过使用移液管倾注微量的熔化的琼脂培养基。 D. ?填充间隙的网状包埋的琼脂培养基。 E.拟南芥的接种。通过筛网生长的拟南芥幼苗。（Yoshimoto等人， 2007）}
³⁵ S标签的准备
1. 制作一个塑料框架，将尼龙网放在装有拟南芥苗的地方。在盖子上切一个矩形窗口[7.5厘米（宽）×9厘米（H）] 的塑料端盒[10cm（W）×12cm（H）×1.5cm（D）] 工具刀。在下面的步骤（步骤）中支撑尼龙网 C4），在塑料框架的两侧放置双面胶带（图2A）。
2. 将50ml液体培养基倒入9cm×9cm正方形培养皿中，并将其置于塑料框架下（图2A）。
3. 拉出尼龙网，其中包含拟南芥幼苗 ?琼脂培养基（图2A）。小心处理他们不要损害根。
4. 小心地放置尼龙网的两边到附接到塑料框架的双面胶带上。然后，使用将尼龙网的两个边缘固定到塑料框架单面胶带（图2B）。通常，4-6条尼龙网可以平行放置在一个塑料框架上（图2C）。后将所有网格放置在框架上，将它们牢固地固定在框架上使用单面胶带（图2D）。淹没根使用镊子在尼龙网下延伸到液体介质中。这种塑料框架设备允许创建大约1厘米在尼龙网下面的液体介质表面上方的空间。最后，放置一个透明的塑料容器[13厘米（宽）×13厘米（H）×3 ?cm（D）]底面朝上以覆盖保持植物的塑料框架（图2E）。这防止了植物地上部分的干燥。孵育植物> 10分钟。
5. 制备35S-标记培养基：将[35 S]硫酸钠（Na 2 SO 4，SO 4 SO 4）水溶液加入到液体介质。通常，添加适量的Na 2 SO 4和SO 4 SO 4，是液体介质中包含的总硫酸盐的0.5-5％。
  
  图2.装有尼龙的塑料框架装置的示意图 ?网状和拟南芥幼苗。 A.组织尼龙网，保持拟南芥幼苗，具有双面胶带的塑料框架 ?（黄色）和含有液体培养基的正方形培养皿。乙。装有尼龙网和拟南芥苗的塑料框架。一个正方形 ?培养皿放置在塑料框架下面。两边的尼龙网放置在附接的双面胶带上塑料框架，并用单面胶带（橙色）固定。拟南芥的根被浸没在液体培养基中。 C.塑料框架，其含有拟南芥幼苗的四条尼龙网。 D. 塑料框架装置的最终设置准备用于³⁵ S标签 ?实验。四个尼龙网带牢固地固定在塑料上 ?框架使用单面胶带（棕色）。 E.最终设置的塑料框架装置准备好用于 S标记实验由一个防止干燥的透明塑料容器覆盖 ?植物的地上部分。（Yoshimoto等人，2007）
³⁵ S标记根部
1. 要开始³⁵ S标记，请取下透明塑料容器[13厘米（W）×13cm（H）×3cm（D）]，并覆盖植物整个塑料框架装置包括顶部的网和幼苗的9cm×9cm正方形培养皿，其含有50ml的35S-标记中。使用镊子将根浸入35S-标记的培养基中。放置一个透明的塑料容器[13厘米（宽）×13厘米（H）×3厘米（D）] ?返回到覆盖塑料框架装置和植物的位置防止孵化期间植物的地上部分干燥。然后，孵化植物10-60分钟，取决于目标实验
2. 为了停止^{S标记，在60ml的未标记的液体培养基中在9cm×9cm正方形培养皿中冲洗拟南芥的根菜肴}
3. 洗去剩余的放射性根的非成形空间，将根浸没在75ml的未标记的液体介质。放置一个透明的塑料盒[13厘米（宽）×13厘米（H）×3 ?cm（D）]在塑料框架装置和植物上以防止干燥 ?的植物地上部分。孵化植物60 ?min。
4. 收获来自步骤D2或D3的植物组织。先删除尼龙网和植物从塑料框架，然后切根下面的尼龙网使用外科剪刀，并分离根和 ?植物的地上部分与网格分开。取出液体 ?通过使用纸巾保留在根表面上。称重新鲜使用分析天平测定植物组织的重量。
结合放射性的测定
1. 将收获的植物组织（<200mg FW）置于液体闪烁瓶中。
2. 在单独的小瓶中，制备用于校准的标准样品使用等分的来自步骤C5的35S-标记的培养基（例如 0，1，3，10，30和100μl）
3. 加入1ml的100mM 盐酸并在室温下轻轻摇动小瓶过夜温度在黑暗中使用振动器，消化植物组织
4. 加入2ml Ultima Gold ^TM闪烁鸡尾酒，并彻底混合
5. 使用液体闪烁计数器测量放射性。
6. 通过绘制硫酸盐的量生成校准曲线相对于标准样品的放射性。计算金额使用校准曲线测定植物组织中的35 S-硫酸酯。计算硫酸盐吸收速率基于引入的35 S-硫酸盐的量 ?到植物组织中，除以植物组织的鲜重（步骤 D4）和用于在35S标记培养基中孵育的时间段（步骤D1）。植物中根茎间的硫酸盐分布可以是基于在单独检测的放射性的量估计根和芽。

笔记

琼脂和液体培养基的组成，35 S-标记培养基中的[35 S]硫酸钠的浓度和标记期可以根据研究而变化目标（例如，高或低亲和力硫酸盐摄取速率的测量）。该协议改编自Kataoka等人（2004a），Kataoka等人（2004b），Maruyama-Nakashita （2004），Maruyama-Nakashita等人（2006），Maruyama-Nakashita等人（2015）和Yoshimoto等人/em>（2007）。

致谢

N.Y.接收JSPS KAKENHI授权号26460118的授权支持。获得JSPS KAKENHI Grant号24380040和15KT0028的资助支持。 H.T.获得国家科学基金会（MCB-1244300）和AgBioResearch的资助。

参考文献

Kataoka，T.，Hayashi，N.，Yamaya，T.and Takahashi，H。（2004a）。拟南芥中根硫酸根的转运。证明SULTR3; 5作为低亲和力硫酸盐转运系统在根系脉管系统中的作用的作用。植物生理学136（4）：4198-4204。
Kataoka，T.，Watanabe-Takahashi，A.，Hayashi，N.，Ohnishi，M.，Mimura，T.，Buchner，P.，Hawkesford，M.J.，Yamaya，T.and Takahashi，阴极硫酸盐转运蛋白是控制拟南芥中硫酸盐内部分布的必要决定因素。植物细胞 16（10）：2693-2704
Li，X。（2011）。拟南芥生长协议 - 一般指南生物协议 Bio101：e126。
Maruyama-Nakashita，A.，Nakamura，Y.，Yamaya，T.and Takahashi，H。（2004）。拟南芥根中硫酸盐摄取的新型调节途径：CRE1的影响/WOL/AHK4介导的细胞分裂素依赖性调节。
38（5）：779-789。
Maruyama-Nakashita，A.，Nakamura，Y.，Tohge，T.，Saito，K.and Takahashi，H。（2006）。拟南芥 SLIM1是植物硫反应和代谢的中枢转录调节剂。植物细胞 18（11）：3235-3251。
Maruyama-Nakashita，A.，Watanabe-Takahashi，A.，Inoue，E.，Yamaya，T.，Saito，K.and Takahashi，H。（2015）。 3'-非转录基因间区域中的硫反应元件对于诱导SULFATE TRANSPORTER 2非常重要;在硫缺乏的情况下在拟南芥根中的1个基因表达。植物细胞27（4）：1279-1296。
Yoshimoto，N.，Inoue，E.，Watanabe-Takahashi，A.，Saito，K.and Takahashi，H。（2007）。硫营养对拟南芥中高亲和力硫酸转运蛋白的转录调控。 Plant Physiol 145（2）：378-388。