材料和试剂

肿瘤细胞[特别地，该测定用于H1299非小细胞肺癌细胞（ATCC，目录号：CRL-5803）和乳腺癌细胞系MDA-MB-231（ATCC，目录号：HBT-26），
MDA-MB-417.5（由JoanMassagué友情提供）和Hs578T（ATCC，目录号：HBT-126）]
没有Ca/Mg（任何供应商）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）
胰蛋白酶-EDTA（Life Technologies，Invitrogen ）
来自牛血浆的纤连蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：F1141）
在制造商（Thermo Fisher Scientific，目录号：C37238）提供的MSDS/COA文件中给出白色羧酸酯改性的乳胶珠（CML Latex Beads，4％w/v，0.4μm） >
黑色96孔平底显微镜板（μClear96孔板）（Greiner Bio-One GmbH，目录号：655090）
4％甲醛（任何供应商）在PBS
中
RPMI培养基（Life Technologies）
胎牛血清（FBS）（PAA Laboratories）
青霉素 - 链霉素（青霉素 - 链霉素）（Life Technologies，Gibco ）
完整媒介（见配方）

设备

细胞培养装置，包括层流罩，细胞培养培养箱（37℃和5％CO 2），细胞计数器或计数室，多通道移液器
BD Pathway 855 BioImager（BD Biosciences）;或另一品牌或类型的倒置显微镜，配备明场照明，自动舞台，10x物镜和自动化成像软件
Hydroflex洗板机（Tecan Trading AG）

软件

WIS-PhagoTracker v2_3_12（Weizmann Institute of Science， http：//www.weizmann .ac.il/vet/IC/software/wis-phagotracker ;开源软件）
Montage2MRC（Weizmann Institute of Science， http://www.weizmann.ac。 il/vet/IC/software/wis-phagotracker ;开源软件）
KNIME（可选）（ www.knime.org ;开源软件）

程序

第1天
1. 在无菌层流罩中，加入40μl/孔纤连蛋白（10μg/ PBS）至96孔μClear平板。将板转移到细胞培养物培养箱中并在37℃下孵育1小时
2. 吸出纤连蛋白而不刮擦表面，并用PBS洗涤两次（优选使用洗板机）。每孔加入100μlPBS，继续下一步步骤。
3. 旋转储备烧瓶的CML乳胶珠和等分试样250μl ?珠（约3.25×10 11个颗粒），并旋转 13,000rpm，5分钟。弃去上清液并重悬细胞小球在1 ?ml PBS。涡旋1分钟并在13,000rpm离心5分钟。去掉上清液和重悬的珠粒在1ml PBS中。转移重悬珠至15或50ml管，并加入PBS至最终珠悬浮液体积 ?每板7ml
4. 从纤维连接蛋白包被板除去PBS，不刮表面，每孔添加70微升的珠。
5. 目视检查板，确保井的表面完全用珠子覆盖并在37℃下孵育1小时
6. 使用洗板，并用PBS（每孔200μl）轻轻洗涤7次。如果不洗板机，可用手动小心清洗板多通道，并确保珠涂层表面不被划伤。后洗涤，每孔加入100μlPBS
7. 包装在parafilm板和存储板在4°C第二天使用
8. 我们建议为每个实验准备新鲜的珠子（如上所述），避免长期储存。
第2天
1. 小心地从珠涂布板吸取PBS，并更换为100微升完全培养基
2. 从培养瓶中制备细胞（例如，或siRNA转染后），并重悬于单细胞悬液中。
3. 种子50-200细胞在50微升单细胞悬液（取决于细胞大小&迁移能力）和返回板细胞培养孵化器。最终体积为150μl（100μl完全培养基+50μl 单细胞悬浮液），其中将允许形成50-200个细胞单细胞迁移轨迹。
4. 我们建议允许细胞在加入化合物或抑制剂之前附着1小时
5. 根据迁移能力，在细胞7-12小时后固定细胞通过从板中移除140μl培养基并加入70μl4％甲醛（最终甲醛浓度为3.5％）。固定为10 min
6. 用PBS洗涤平板两次（每孔200μl），不划伤涂有珠子的表面
7. 包装在parafilm板，存储在4°C，直到成像
  
  图1. PhagoKinetic轨迹测定的显微镜设置。。原始明场图像中的非均匀照明是通过添加光扩散器（提示盒盖）最小化，提供清晰图像具有相等的强度。 B.最大的无缝蒙太奇正方形没有单元格边框（红框）允许用户记录a 最大数量的完整单元轨道。
成像和分析
1. 使用明场显微镜与10倍物镜可视化无珠迁徙轨道。如下获得全井蒙太奇：
  1. 透射光源在96板的上方。为平等照明，在平板的顶部放置小盒盖以扩散光（见图1a）。
  2. 在获取之前，在每个孔中使用激光自动对焦进行对焦
  3. 使用蒙太奇设置获取井的最大蒙太奇，没有成像井边界（例如图1b）。
2. 按照软件说明，使用Montage2MRC将一个版面的所有蒙太奇图像转换为单个r6d文件。
3. 运行PhagoTracker软件并根据图像分析软件指南（图2a-b）。 PhagoTracker用户指南非常详细和包含大量的信息，以优化您的形象分析。简单地说，使用以下设置：
  1. 在预处理中，将正确照明设置为"非"
  2. 使用高通&低通滤波器，并将"调整对比度"设置为"整体"
  3. 对于轨道检测，我们使用推荐的阈值设置。根据灰度值，总强度，单元尺寸和轨道尺寸，您可能需要找到最佳设置。
  4. 使用轨道过滤拒绝没有单元的轨道和拒绝具有多于1个单元的轨道。简而言之，软件检测明亮的物体（迁移路径）和黑暗对象（单元格）。它随后确定每个洄游路径（具有1个单元格的1个路径）或拒绝（1个路径，0个单元格，或1个具有> 1个单元的路径）。轨道也可以手动接受或拒绝 ?分析后。如果图像分析参数不是必需的设置正确。
4. PhagoTracker计算多个形态测量 ?每个迁徙轨道的特征，包括总面积，净面积，小轴，主轴，轴比和周长作为测量轨道尺寸和形状。此外，每个的稠度和粗糙度轨迹，其代表膜活性和波状起伏（图2c-d）。软件生成2个文件定量输出：一个文件包含所有接受的个人的数据轨迹，另一个包含的平均值和标准偏差接受，拒绝和每个井的所有轨道。
5. 定量输出可以使用PhagoTracker（请参阅用户指南）进行进一步分析使用首选程序（如Excel，Graphpad，R或KNIME）进行处理。
  1. 为了自动化您的分析，建议使用KNIME。这个开源软件包含大量即用型分析节点，包括a ?板铺板，不同的标准化方法（Z-score， B-score，NPI，POC，等）和绘图工具（2D/3D散点图，等）以构建分析管道
    
    图2. PhagoTracker软件和图像分析程序。 A. PhagoTracker软件界面。乙。 PhagoTracker软件在几个步骤中执行图像分析。图片被预处理以增强对比度和正确的照明。多尺度分割发现候选单元格和路径段（如图所示）分别为橙色和蓝色），随后将其组合轨道段。基于该选择来过滤候选轨迹 ?标准，并标记为确认（红色）或拒绝（蓝色）。 C。 ?Hs578T乳腺癌细胞的代表图像。对照细胞显示 ?大长条轨道与粗糙的边界。细胞用siRNA敲除（KD）不迁移并形成圆形轨道。 D.量化单个磁道，如C.中所示。密实度计算为（磁道面积/ 凸包的面积）和粗糙度为（周长<2/d>）/（4π*总区）。

笔记

重要注意事项

关于板的准备：
1. 有一个非常小，可忽略的风险，你洗掉珠子，但这只会发生，如果你使用很大的力。在现实中，这个问题 ?永远不会发生。
2. 这是很容易轻轻拍打或摇晃（水平）板以分布珠溶液并覆盖表面的井。此协议使用过量的珠和珠通过沉降涂覆，因此覆盖非常均匀。
在任何时候，不要划伤板的底部。珠涂层中的划痕可以表现为迁移轨迹，并可能影响分析。一般来说，小/小划痕可以忽略，因为它们不影响分析。事实上，如果划痕被检测为轨迹，则其中没有细胞，因此它将被拒绝
这个协议可以用于其他细胞系，但我们建议一个试点实验找到使用的任何细胞系的最佳条件。这些包括：
1. 珠的尺寸，类型和表面电荷。不同尺寸，类型和珠粒的电荷已经过测试，并且被清楚地描述 Naffar-Abu-Amara等人简要地说，大小为340的CML乳胶珠或 400 nm工作效果最好。具有低电荷密度的珠子将强烈相互作用 ?与孔的表面和因此细胞不能去除珠子，因为他们迁移。在本协议中使用的珠子有电荷密度为85-100μEq/g，可用于广泛的细胞。的目录号在材料和试剂部分提供允许用户订购相同的珠子。
2. 最佳细胞密度，这取决于几个参数，如单元格大小（更大细胞，密度越低）和细胞运动性（越高速度，细胞密度越低）。
3. 迁移时间。较少的活动细胞系可能需要更长的迁移轨迹形成的孵育时间瞄准最大数目的无珠迁移轨道在结束该测定不相交。可以检查轨道交叉视觉上。你看到1明亮的轨道和2个单元格，指示交叉或细胞分裂（图2b，第一图）。 PhagoTracker ?软件保存路径（迁移轨迹）和细胞图像（图2b，第三图）。你可以决定是否自动拒绝磁道，以及哪些标准用于拒绝。

食谱

完成媒介
RPMI培养基补充有10％胎牛血清和25IU/ml青霉素和25μg/ml链霉素。

致谢

该方案是基于Naffar-Abu-Amara等人（2008）开发的，并且在莱顿大学莱顿学术药物研究中心的毒理学部进一步优化。该工作由来自EU-FP7-系统显微镜NoE（批准号258068至B.van de Water）和荷兰癌症协会（UL2007-3860）的赠款资助。

参考文献

Naffar-Abu-Amara，S.，Shay，T.，Galun，M.，Cohen，N.，Isakoff，S.J.，Kam，Z.and Geiger，B。（2008）。使用定量，基于显微镜的筛选鉴定新型促洄选，癌症相关基因。 a> PLoS One 3（1）：e1457。
Sharon，E.，Galun，M.，Sharon，D.，Basri，R。和Brandt，A。（2006）。分割视觉场景中的层次和适应性自然 442 （7104）：810-813。
van Roosmalen，W.，Le Devedec，SE，Golani，O.，Smid，M.，Pulyakhina，I.，Timmermans，AM，Look，MP，Zi，D.，Pont，C.，de Graauw， Naffar-Abu-Amara，S.，Kirsanova，C.，Rustici，G.，Hoen，PA，Martens，JW，Foekens，JA，Geiger，B.and van de Water，肿瘤细胞迁移屏幕将SRPK1鉴定为乳腺癌转移决定因素。 Invest 125（4）：1648-1664。