材料和试剂

显微镜载玻片（Thermo Fisher Scientific）
＃1.5盖玻片（0.17mm厚）（Thermo Fisher Scientific）
表达荧光标记的BY2细胞
250ml锥形瓶（Thermo Fisher Scientific）
Murashige和Skoog（MS）基础盐培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M5519）
蔗糖（Thermo Fisher Scientific）
（2,4-二氯苯氧基）乙酸钠盐一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：D6679）
Calcofluor白/荧光增白剂28（Sigma-Aldrich，目录号：F3543）
1 M D-甘露醇纯（Scientific Laboratory Supplies，目录号：CHE1796）
指甲油
BY2生长培养基（参见食谱）
Calcofluor白色库存解决方案（参见配方）

设备

控制温度（28°C）孵化器或房间
轨道振动器
PersonalDV Deltavision荧光反转显微镜（GE Healthcare，Dharmacon）
3D-SIM显微镜[DeltaVision OMX Blaze（GE Healthcare，Dharmacon），配有Olympus PlanApo N 100x 1.42 NA油目标物]
Edge sCMOS摄像机（PCO AG）

软件

SoftWoRx 6.0（GE）

程序

样品准备
1. 培养40ml稳定表达荧光报道分子的BY2细胞系 ?在具有无菌Murashige和Skoog Basal的250ml Erlenmeyer烧瓶中补充有3％蔗糖和2μg/ml的2,4-二氯苯氧基乙酸的盐培养基。在28℃，黑暗中培养培养物 140rpm的轨道振荡器。无菌培养细胞至新鲜每周使用1ml细胞稀释至40ml培养基。健康 ?文化是淡黄色到浅米色的颜色，应该有足够的生长使细胞悬浮液比粘性更粘稠媒体（图1）。
2. 在4天后亚培养，吸管1毫升细胞进入Eppendorf管，然后染色细胞壁（如果需要）最终浓度为3.5μg/ml的Calcofluor白色5分钟室内温度。通过允许细胞除去过量的染色沉降到管的底部并且将培养基更换为新鲜，两次。
3. 通过去除450μl的培养基并用450μl的1M甘露醇代替它来分离质粒细胞注意：不需要溶血，但是使我们能够更准确地观察plasmodesmata。
4. 在室温孵育10分钟，轻轻倒转管每2分钟保持细胞悬浮，然后吸取40微升的细胞到显微镜载玻片上。在上面轻轻地放置一个矩形盖玻片。使用折叠的平片轻轻地压下多余的介质吸收薄纸。
  注意：重要的是不要损坏细胞，所以压力必须很轻。
5. 用指甲油密封盖玻片的所有边缘，并在清漆干燥后立即开始成像
6. 使用PersonalDV DeltaVision定位用于成像的候选细胞活细胞成像系统，其具有映射到OMX的载物台坐标。 ?使用低级明亮场照明并标记位置使用点访问工具滑动
7. 将所有标记的单元格公开适当波长的荧光灯来检查calcofluor 染色（_{abs 350nm/ 455nm）已经工作良好，并且细胞表达良好水平的荧光报告物（图2）。这是至关重要的以使这种暴露尽可能简短以便最小化在3D-SIM成像之前漂白。点访问功能允许在OMX上迅速找到标记的单元格，从而避免不必要的曝光。}
3D-SIM成像
1. 我们使用DeltaVision OMX Blaze获得3D-SIM图像 Olympus PlanApo N 100x 1.42 NA油目标。 3D-SIM成像协议基于Schermelleh等人（2010）中描述的方法。地点 ?在OMX上滑动并涂抹浸油。最小化球面像差和优化照明调制对比度，调整类型的浸油以匹配样品的折射率（RI）和成像深度。理想地，BY2细胞将安装在甘油或类似于保持油浸物镜的RI但保持 ER处于良好状态时，细胞必须安装在培养基中。细胞也需要尽可能接近盖玻片。
2. 找出使用点列表和螺旋马赛克功能选择单元格以使图像中的单元格居中。确定的上限和下限 z-stack快速有效，继续最小化单元格曝光。
3. 在OMX 3D-SIM系统中，光从固体（405,488和564nm），由高速倾斜反射镜关闭 ?并耦合成宽带单模光纤被分离三光束。生成样本平面中的3D干涉图案通过将光束聚焦到物镜的后焦平面上。条纹照明图案偏移五个相位步长和旋转3个角度（-60°，0°和+ 60°），提供一组15个图像每个未处理的z截面。干扰模式相移引导外部两个光束通过单独的一对窗口个人倾斜控制。样品处的干涉图样的相位 ?平面由于路径长度的变化而偏移相应的外光束，而横向折射光束平移通过在给定的窗口对在互补方向上倾斜来取消。图案取向的角度由倾斜反射镜偏移，引导所述三个光束图案化为三个反射镜组中的一个;梁来自三个旋转路径中的每一个的图案被重定向回到a 公共出口路径通过从所述倾斜反射镜反射第二时间。对于说明图请参见 http://microscopy.lifesci.dundee.ac.uk/omx/omx.html。
4. 选择最低可能的激光功率和每个通道的曝光时间最小化照片漂白。通常，调整曝光时间类似在100和200 ms之间，并且还调整每个激光器的功率在原料中实现1,000和3,000之间的最佳强度图像由15位动态范围边缘sCMOS摄像机采集。获得图像堆栈。
5. 未处理的图像堆栈由15个图像组成（每三个干涉的五个相移图像）图案角度）。显微镜必须定期校准测量信道特定光学传递函数（OTF）以进行优化 ?包括横向和轴向图像分辨率。
6. 调整图像 ?不同的颜色通道，记录在单独的相机上，与 SoftWorx 6.0对齐工具，基于从中获得的对齐参数 ?用100nm直径的TetraSpeck珠进行校准测量。使用SoftWoRx 6.0重建超分辨率3D图像堆栈信道特定OTF和维纳滤波器设置为0.002。

代表数据

图1.健康的4天老的BY2细胞培养

A.表达RTN6的GFP细胞的BY2细胞的标准共聚焦图像：GFP（绿色）和用Calcofluor白色染色的细胞壁（图2）。图2.代表性图像显示使用质谱分离的活BY2细胞的3D-蓝色）。 B.在A中的盒装区域的伪彩色3D-SIM图像，其以高放大倍数显示高分辨率的Hechtian股线。

笔记

3D-SIM显微镜需要相当多的专业知识来操作，不同的制造商使用专门为其硬件设计的定制软件。因此，该协议的3D-SIM成像部分仅作为指导。每个实验将采取协议中概述的所有3D-SIM参数的相当大的优化。

食谱

BY2生长培养基
0.43％MS基础盐介质
3％蔗糖 2μgml -1,2-二氯苯氧基乙酸 ddH sub 2 O
通过高压灭菌
灭菌培养基
Calcofluor白色股票解决方案
170μg/ml ^-1 Calcofluor白色
溶于乙醇
储存在-20°C的黑暗中

致谢

在Dundee大学使用Deltavision OMX Blaze显微镜由MRC下一代光学显微镜奖（参考：MR/K015869/1）支持。该协议的开发是由英国生物技术和生物科学研究委员会（BBSRC）向Karl Oparka授权BB/J004987/1资助的项目的一部分。我们感谢Markus Posch博士的专家协助。该协议的元素已经改编自先前在Bell和Oparka（2015）和Knox等人（2015）中描述的那些。

参考文献

Bell，K。和Oparka，K。（2015）。在超分辨率下成像plasmodesmata的制备方法。 /em> 1217：67-79。
Knox，K.，Wang，P.，Kriechbaumer，V.，Tilsner，J.，Frigerio，L??.，Sparkes，I.，Hawes，C.and Oparka，K。对Plasmodesmata的挤压：网状结构在原代等离子体形成中的作用 Plant Physiol 168（4）：1563-1572。
Schermelleh，L.，Heintzmann，R。和Leonhardt，H。（2010）。超分辨荧光显微镜的指南 J Cell Biol em> 190（2）：165-175。