材料和试剂

总RNA（200 ng?1 ng）
注意：我们使用50?200ng RNA作为起始材料。为了比较实验之间的结果，建议在所有实验中使用相同量的RNA。
推荐使用可纯化小RNA的方法。 TRIzol（Invitrogen，目录号：15596-018）或miRNeasy Mini Kit（QIAGEN，目录号：217004）。通过分光光度计检查RNA的纯度。为了实验的一致性，始终使用具有A ₂₆₀ /A ratio> 1.8。
注意：目前， -018"。
PCR级蒸馏水
用于PCR和实时PCR的Microtubes（MicroAmp光学8-Cap条）（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ，目录号：4323032）
DNase I（与酶一起提供10x缓冲液）（Roche Diagnostics，目录号：04716728001）
逆转录试剂（Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit）（Roche Diagnostics，目录号：04897030001）
关键点：建议使用Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒测量ms ²修饰。与其他逆转录试剂盒相比，该试剂盒具有最高的动态范围。
实时PCR试剂（SYBR Premix Ex Taq II）（TAKARA BIO INC。，目录号：RR820S）
注意：来自其他公司的SYBR green基PCR试剂同样良好。
用于检测人RNA样品中线粒体ms ^{2修饰的引物
Hu_tRNA ^Phe引物f1：CTCCTCAAAGCAATACACTG

Hu_tRNA ^Phe引物r1：AGCCCGTCTAAACATTTTCA

Hu_tRNA ^Phe引物r2：GGGTGATGTGAGCCCGTCTA

Hu_tRNA ^SerUCN引物f1：GAGGCCATGGGGTTGG

Hu_tRNA ^SerUCN引物r1：CCCAAAGCTGGTTTCAAGC

Hu_tRNA ^SerUCN引物r2：AATCGAACCCCCCAAAGC

Hu_tRNA ^Trp引物f1：GGTTAAATACAGACCAAGAGC

Hu_tRNA ^Trp引物r1：CAACTTACTGAGGGCTTTGAA

Hu_tRNA ^Trp引物r2：TTAAGTATTGCAACTTACTGAGG

Hu_tRNA ^Tyr引物f1：GCTGAGTGAAGCATTGGACT

Hu_tRNA ^Tyr引物r1：AACCCCTGTCTTTAGATTTACA

Hu_tRNA ^{Tyr 引物r2：AGAGGCCTAACCCCTGTCTT}}
用于检测小鼠RNA样品中线粒体ms ²修饰的引物
1. Ms_tRNAPhe引物f1：GCTTAATAACAAAGCAAAGCA
2. Ms_tRNAPhe引物r1：TATCCATCTAAGCATTTTCA
3. Ms_tRNAPhe引物r2：TGGGATACAATTATCCATCT
4. Ms_tRNA ^SerUCN引物f1：CATATAGGATATGAGATTGGC
5. Ms_tRNA ^SerUCN引物r1：AACCCCCTAAAATTGGTTTCA
6. Ms_tRNA ^SerUCN引物r2：GAAGGAATCGAACCCCCTAA
7. Ms_tRNA ^Trp引物f1：GGATATACTAGTCCGCGAGC
8. Ms_tRNA ^Trp引物r1：GTGTTTTCTTAGGGCTTTGA
9. Ms_tRNA ^Trp引物r2：GTTAAACTTGTGTGTTTTCTTAG
10. Ms_tRNA ^Tyr引物f1：ATGGCTGAGTAAGCATTAGA
11. Ms_tRNA ^Tyr引物r1：ACCTCTGTGTTTAGATTTAC
12. Ms_tRNA ^{Tyr 引物r2：GAGGATTTAAACCTCTGTGT
  注意：标准PCR等级引物对于该方案是足够的。
  r1引物用于测量总tRNA水平，r2引物是。
  用于测量个体tRNA中的ms ² - 修饰水平。}

设备

常规PCR装置（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ，型号：Veriti 96 Well Thermal Cycler）
实时PCR装置（Life Technologies，Applied Biosystems ，型号：7300实时PCR系统）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，型号：7300实时PCR系统"。

程序

DNase处理

从人或动物的细胞和组织样品制备总RNA TRIzol试剂或miRNeasy试剂盒指令。
将以下试剂混合在微管中，在冰上进行DNase处理

组件
体积（μl/反应）

RNA（100ng /μl）
2

DNase I
0.5

10x DNA酶I缓冲液
2

PCR级水
15.5

总量
20

注意：为了测量多个样本中的ms ²修改，建议制备除RNA以外的所有试剂的主混合物减少变异性。当制备主混合物时，通常是希望准备稍微过量以补偿移液不准确。
将微管放入PCR仪中，使用以下程序

时间和温度

消化
停用
暂停

37℃20分钟
75℃10分钟
4°C
使用DNase I处理的样品进行随后的逆转录或储存在-80°C。

第二部分。反转录

图1.检测ms ²修饰的方法的工作流程。线粒体tRNA分别由r1引物和r2引物反转录。由于rs2引物对逆转录的抑制作用，由r2引物（绿线）产生的cDNA的量高度依赖于rs2引物中的ms ^{2水平。给定RNA样品。另一方面，由r1引物（蓝线）产生的cDNA独立于ms 2水平，并且可以用作内部对照。通过使用f1和r1引物的随后的定量PCR（qPCR）定量每种cDNA的量。}

对于每种tRNA种类，将DNA酶I消化的RNA与引物r1或引物r2在冰上混合

组件	体积（μl/反应）
	示例（r1）	示例（r2）
DNase消化的RNA	2.5	2.5
引物r1（10μM）	1	-
引物r2（10μM）	-	1
水	3	3
总量	6.5	6.5

注意：建议准备所有试剂的主混合物除了RNA以减少变异性。当制备主混合物时，它是 ?通常需要制备稍微过量以补偿移液不准确。

使RNA在65℃变性10分钟，并立即将样品在冰上放置1分钟
如下在冰上加入包含在Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒中的RT酶和缓冲液 < table height ="167"border ="1"bordercolor ="＃000000"cellpadding ="2"cellspacing ="0" width ="310"> 组件
体积（μl/反应）

示例（r1）
示例（r2）
变性RNA
6.5
6.5
5x缓冲区
2
2
核糖核酸酶抑制剂
0.25
0.25
dNTP Mix
1
1
酶
0.25
0.25
总量
10
10
注意：建议准备所有试剂的主混合物除了RNA以减少变异性。当制备主混合物时，它是 ?通常需要制备稍微过量以补偿移液不准确。
根据以下程序执行逆转录。

时间和温度

反应
停用
暂停

55℃30分钟
85℃5分钟
4°C
样品准备用于定量PCR。否则，样品可以储存在-20°C。

第三部分。定量PCR

混合试剂如下。如果使用其他SYBR基于绿色的PCR试剂盒，请按照制造商的说明推荐

组件	体积（μl/反应）
	示例（r1）	示例（r2）
SYBR Premix Ex Taq	10	10
引物f1（10μM）	0.4	0.4
引物r1（10μM）	0.4	0.4
ROX参照染料	0.4	0.4
cDNA	2	2
水	6.8	6.8
总量	20	20

注意：建议准备所有试剂的主混合物除了cDNA以减少变异性。当制备主混合物时通常期望制备稍微过量以补偿移液不准确。

设置程序如下，并运行实时PCR。如果需要，添加解离阶段。

时间和温度

第一步
PCR（40个循环）

热激活
变性
退火/延伸

暂停
循环

95°C 30秒
95°C 5秒
60℃，31秒

第四部分。数据分析
分析样品（r1）和（r2）的数据以获得Ct值。所获得的结果样品（r1）和（r2）分别代表个体tRNA中的总tRNA水平和ms ^{2修饰水平。
任何给定RNA样品中的归一化修饰水平计算为dCt = Ct（r2）-Ct（r1）。因为dCt值精确地反映修饰水平（Xie等人，2013），所以dCt值可以直接用于多个样品之间的修饰水平的比较（关于代表性数据，参见下文）。}

代表数据

图2.测量ms ² mt-tRNA水平 ^Tyr 在野生型小鼠心脏组织中。使用TRIzol从小鼠心脏组织纯化总RNA，然后2-丙醇沉淀。 RNA样品调节至100ng /μl，并如上所述进行分析。显示了使用r1引物（绿色）和r2引物（蓝色）的代表性扩增曲线。 Ct（r2）= 14.8，Ct（r1）= 10.7。野生型小鼠心脏中的修饰水平（dCt）= 14.8-10.7 = 4.1。

图3.测量ms ² mt-tRNA水平 ^Tyr 在 Cdk5rap1 KO m 的心脏组织中<不含有ms ²修饰的Cdk5rap1 KO小鼠。 RNA样品调节至100ng /μl，并如上所述进行分析。显示了使用r1引物（红色）和r2引物（蓝色）的代表性扩增曲线。 Ct（r2）= 10.4，Ct（r1）= 10.4。 Cdk5rap1 KO小鼠心脏中的修饰水平（dCt）= 10.4-10.4 = 0.

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图4.野生型（WT）和Cd k5rap1 KO小鼠的心脏组织中mt-tRNA ^Tyr的修饰水平的比较。

致谢

该方案的概念改编自我们以前的研究，其中定量PCR用于测量细胞溶质tRNA（UUU）中的ms ^{2修饰 et al。，2013）。在我们最近的研究中，我们已经成功地使用该方案来测量ms ²修饰线粒体tRNA（Wei等人，2015）。这项工作得到了日本教育，文化，体育，科学和技术部的科学研究资助。}

参考文献

Wei，FY，Zhou，B.，Suzuki，T.，Miyata，K.，Ujihara，Y.，Horiguchi，H.，Takahashi，N.，Xie，P.，Michiue，H.，Fujimura，A.，Kaitsuka ，T.，Matsui，H.，Koga，Y.，Mohri，S.，Suzuki，T.，Oike，Y.and Tomizawa，K。（2015）。 Cdk5rap1介导的线粒体tRNA的2-甲硫基修饰控制蛋白质翻译并促进小鼠和人类的肌病。 Cell Metab 21（3）：428-442。
Xie，P.，Wei，F.Y.，Hirata，S.，Kaitsuka，T.，Suzuki，T.，Suzuki，T.and Tomizawa，K。（2013）。用于评估2型糖尿病风险的tRNA 2-甲硫基修饰的定量PCR测量。 em> Clin Chem 59（11）：1604-1612。