材料和试剂

超离心管，32ml容量，厚壁，聚碳酸酯（Beckman Coulter，目录号：355631）
3 ml pastettes
Solanum lycopersicum Lam。简历。 M82或cv。微汤姆
牛血清白蛋白（级分V）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
D-甘露糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：M9647）
硫酸镁七水合物（Thermo Fisher Scientific，目录号：10256840）
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：E4884）
聚乙烯吡咯烷酮平均分子量为40,000（Sigma-Aldrich，目录号：PVP40）
2-氨基-2-（羟甲基）-1,3-丙二醇（Trizma底物）（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
丁基化羟基甲苯（Sigma-Aldrich，目录号：W218405）
将亚硫酸氢钾（K 2 S 2 O 5）（Sigma-Aldrich，目录号：P2522）
苯基甲基磺酰基fluouride（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
乙醇（Thermo Fisher Scientific，目录号：12468750）
（+） - L-抗坏血酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：A7631）
DL-二硫苏糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
氢氧化钾（Thermo Fisher Scientific，目录号：10366240）
甘油（Thermo Fisher Scientific，目录号：10296200）
BIS-TRIS丙烷（Sigma-Aldrich，目录号：B6755）
Tricine（Sigma-Aldrich，目录号：T0377）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：SO389）
平纹布（100％纯棉）
2 - （N，N-吗啉代）乙磺酸（MES）（Sigma-Aldrich，目录号：M3671）
提取缓冲液（参见配方）
重悬缓冲液（见配方）
蔗糖步骤（参见食谱）
传输缓冲区（请参阅配方）

设备

Scalpel Handle Swan Morton No.4（Philip Harris，目录号：B8R00181）
手术刀片Swan Morton No.24（Thermo Fisher Scientific，目录号：11712734）
搅拌机（例如带有40盎司容器的Waring 38BL41）
带有转出转子（例如SW28 Ti）的能力为100,000 x g的超离心机。
软漆刷（Sable No.5或同等品）
1,000μl微量移液器

程序

这里详述的核心程序设计为隔离高纯度质膜囊泡进行蛋白质组学分析。包括对梯度梯度的修饰，其允许适合于运输测定的更高产量的制备。与所有细胞器分离程序一样，产率和纯度之间的平衡将取决于下游应用。例如，蛋白质组学方法由更高纯度的膜促进，而转运测定需要更高的膜产量。该方案的规模可以容易地适用于20g至80g的起始材料，保持相同比例的植物生物质缓冲。
该程序在4℃，在冷室中，使用预冷设备和新制备的溶液在冰上孵育4小时，然后开始。

均质化在搅拌器中用150ml提取缓冲液（参见配方1）将60g番茄果实果皮[外皮（外皮）除去]（参见图1）。
注意：为了最小化加热，水果以6×3秒的高速脉冲匀浆。

图1.用于均化的番茄果皮果皮的制备。图A显示了四分之一的番茄果实，其具有果皮组织和外果皮的区域标记。图B显示了在除去外果皮和荚果之后准备用于匀浆的同一季度
通过2层细棉布过滤匀浆，并均匀地分布在6个超离心管之间。通常收集约180ml滤液，每个离心管约有30ml滤液注意：应该快速过滤，避免发泡。
将匀浆以20,000×g离心20分钟。
注意：这是一个初始澄清旋转，以清除细胞碎片和线粒体。
将上清液转移至干净的超离心管中，并以100,000xg离心60分钟。
注意：这将从上清液中沉淀膜。
在离心期间准备2步梯度。在干净，干燥的超离心管层中加入5ml 32％蔗糖，5ml 24％蔗糖，10ml 12％蔗糖和5ml 6％蔗糖（见蔗糖溶液的配方3）。保持梯度在4°C直到需要注意：
1. 如果膜用于转运测定，则简化梯度 ?由12ml的24％和12ml的6％蔗糖组成。
2. 梯度的示意图如图2A和C所示。
3. 视频1中显示了如何分层蔗糖溶液的简短视频。
视频1.分层蔗糖溶液视频显示24％蔗糖溶液层叠在32％ ?蔗糖。注意刚刚上方的pastette的起始位置弯月面的32％蔗糖层。软膏慢慢升起保持与增长的24％

图2.用于液泡膜囊泡分离的蔗糖步骤梯度在高纯度A和高产量C方案的步骤5中制备的蔗糖步骤梯度的示意图。图B和D显示了步骤8中离心后的梯度的实例。待收获的中间相用三角形表示。这些梯度已经用于从成熟的红色水果中分离膜
在步骤4中离心后除去上清液，理想地，这使用连接到吸气器的200μl微量移液管尖端进行。
注意：将吸头的末端保持在上清液的表面以下会减少粘附在管壁上的液体量（当吸头最佳放置时，应该会听到嘶嘶声）。重要的是避免用尖端接触沉淀，因为这将导致膜损失。
使用软漆刷将所有6个丸重悬于总共5ml的重悬缓冲液（参见配方2）中。轻轻扫过刷的尖端穿过膜沉淀，直到重新悬浮注意：为了最大化产量，首先将沉淀重悬在总共3ml中，然后冲洗管，并用剩余的2ml刷洗并合并。
将2.5ml重悬浮的膜铺在每个梯度的顶部并在100,000×g离心60分钟。
使用配备有45°尖端切割的1000μl移液管（参见视频2）从6％至12％的间期收获膜，并转移至干净的超离心管。
注意：
1. 在这一点上可以汇集来自2个梯度的膜。
2. 用于转运测定的Preps应当从6％-24％的间期收获。
视频2.收获渐变。视频显示如何从蔗糖步骤收获中间相梯度。初始除去高于期望的上部相相间用3ml糊状物进行，这一步骤减少当移液管尖端通过时，污染物从携带通过膜层。注意不要扰乱目标相间在该层上留下约0.5cm的溶液。膜使用1000μl移液器尖端切割至45°收获。
向膜中加入20ml的重悬缓冲液，并以100,000×g离心60分钟。
注意：这会洗膜。
吸出上清液，并在200μl重悬缓冲液中重悬沉淀。
注意：如果膜用于运输测定，则重新悬浮在运输缓冲液中（参见配方4）。
用于在液氮中储存闪速冷冻膜并储存于-80℃

代表数据

图3.囊泡纯度和完整性的评估。通过500μM原钒酸钠（抑制细胞膜ATP酶），500μM钠的抑制作用来评估来自完全A和简化B梯度的膜级分纯度叠氮化物（抑制线粒体ATP酶）或50mM KNO 3（抑制轮状体ATP酶）。 C.通过在洗涤剂Brij 58存在下ATP酶活性的增加来评估来自图B中梯度的6 24％膜级分的轮状体囊泡完整性（终浓度0.015mg ml ^-1）。

笔记

膜级分纯度可以通过使用特定的原生质体，线粒体和质膜ATP酶的抑制剂（Smith等人，1984）通过ATP酶测定法（Oleski等人，1987）来评估。。膜H sup + -ATPase复合物高度指示特异性膜; V型，tonoplast; F型，线粒体; P型，质膜。通过测定膜级分中ATP水解的速率并测量在特异性抑制剂存在下活性的降低，可以测定膜级分的相对纯度，例如参见图3。
膜囊泡的完整性可以通过在存在和不存在非离子表面活性剂58（Sigma-Aldrich，目录号：P5884）的情况下的ATP酶测定来评估。
为了除去外周和可溶性蛋白质，可以进行膜的碳酸盐洗涤。这不应该在运输检测所需的囊泡上进行，因为您将不再具有密封的囊泡
可以使用常见的蛋白质浓度测定法例如Bradford方法通过蛋白质含量评估膜产量。

食谱

提取缓冲
450mM甘露糖 3mM MgSO 4。7H 2 O 3 5mM Na 2 EDTA-dTA 0.5％（w/v）PVP-40 50 mM TRIS
500μM丁羟甲苯
26 mM二硫酸钾 200mM抗坏血酸钠
0.5％（w/v）BSA 1mM PMSF
10 mM DTT
pH 8.0（KOH）
悬浮缓冲液
1.1 M甘油
1mM Na 2 EDTA-EDTA 10 mM BTP
2 mM DTT
pH 8.0（Tricine）
蔗糖步骤
6，12,24和32％蔗糖（w/v）的重悬缓冲液中
传输缓冲区
50mM 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）/BTP（pH 7.0）。
5 mM KCl
5mM MgSO 4。7H 2 O 3 1 mM DTT

致谢

导致该协议的研究的研究由英国生物技术和生物科学研究委员会（授权BB/H00338X/1）和先正达资助。

参考文献

Bettey，M。和Smith，J.A。（1993）。 CAM植物Kalanchoe daigremontiana的液泡膜上的二羧酸盐转运：对蛋白修饰和巯基试剂的敏感性。 Biochim Biophys Acta 1152（2）：270-279。
Oleski，N.，Mahdavi，P.，Peiser，G。和Bennett，A.B。（1987）。番茄果实叶绿体的转运性质：I.阴离子敏感性H-ATP酶的鉴定和表征。 Plant Physiol 84（4）：993-996。
Smith，J.A.，Uribe，E.G.，Ball，E.，Heuer，S。和Luttge，U。（1984）。水稻腺苷酸代谢植物Kalanchoe daigremontiana的液泡ATPase活性的表征。受体调节。 Eur J Biochem 141（2）：415-420。
Snowden，C.J.，Thomas，B.，Baxter，C.J.，Smith，J.A。和Sweetlove，L.J。（2015）。影响番茄果实氨基酸组成的tonoplast Glu/Asp/GABA交换剂。 em> Plant J 81（5）：651-660。