材料和试剂

12孔细胞培养板（Thermo Fisher Scientific，目录号：150628）
100mm细胞培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：172931）
5ml离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339650）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH7.2）（Life Technologies，目录号：20012027）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：20012027" />
100x抗生素 - 抗真菌剂（Life Technologies，目录号：15240062）
注意：目前，是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：15240062" />
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：04330085）
来自溶组织梭菌（Clostridium histolyticum）（Sigma-Aldrich，目录号：C5138）的3,000U/ml胶原酶
1000 U/ml透明质酸酶（Wako Pure Chemical Industries，目录号：08006201）
20mg/ml来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I（Sigma-Aldrich，目录号：DN25）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：SH3091003）
注意：目前，它是"GE Healthcare，目录号：SH3091003"。
青霉素 - 链霉素混合溶液（Nakarai tesque，目录号：2625384）
0.5g/l-胰蛋白酶/0.53mmol/l-EDTA溶液，具有酚红（Nakarai tesque，目录号：3277834）
7-AAD（BD Pharmingen，目录号：5168981E）
CELLBANKER1（Nippon Zenyaku Kogyo Co.，ZENOAQ，目录号：CB011）
洗涤缓冲液（见配方）
消解解决方案（参见配方）
生长培养基（参见食谱）

设备

外科剪刀和镊子
移液器
离心机
细胞培养罩
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养
显微镜
FACS Aria 11流式细胞仪（BD Biosciences）

程序

当甲状腺肿瘤达到合适的大小（约50-500mm <3cm）时，安乐死小鼠（参见视频1和图1）。
使用无菌剪刀暴露和从气管删除甲状腺肿瘤。尽可能小心地除去周围的组织
将甲状腺肿瘤放置在12孔板上，并用2ml冷洗涤缓冲液洗涤几次
使用无菌剪刀在冰上将甲状腺肿瘤切碎成尽可能小的碎片。
将所有肿瘤块收集到15ml离心管中
用5ml洗涤缓冲液通过在4℃下以300rcf离心5分钟洗涤
将肿瘤块重悬在5ml消化溶液中
在37℃孵育60分钟。同时每15分钟轻轻混匀。
在室温下以300rcf离心5分钟，除去上清液
在室温下以300rcf离心5分钟，用5ml洗涤缓冲液洗涤2次
将肿瘤块重悬在10ml生长培养基中，并将其平板在100mm细胞培养皿上
在37℃在5％CO 2中孵育4?5天
你会看到一些细胞附着在盘子上并生长，而主要的细胞群是漂浮的
收集所有含有浮动细胞的培养基到15ml离心管中
加入1毫升生长培养基到100毫米细胞培养皿，洗涤，并回收到15毫升离心管。重复此步骤至少两次，以恢复所有浮动单元格。
在室温下以300rcf离心5分钟，弃去上清液，将细胞重悬于10ml生长培养基中，并将它们平板接种到新的100mm细胞培养皿上。
加入10毫升生长培养基到使用的100毫米细胞培养皿，并保持附着的细胞在细胞培养孵化器作为粘合剂种群。
在3-4天培养后重复步骤13-17至少3-4次，直到附着的细胞从浮游细胞中不出现，以便完全分离非粘附群体与粘附群体。
您将检测C细胞的标记物，如降钙素和Ascl1阳性细胞在非粘附性人群中高度富集。
死细胞应通过细胞分选仪使用染色试剂如7-AAD在某些应用中除去
非粘合剂和粘合剂群可以储存在具有细胞储存溶液例如CELLBANKER1的液氮罐中。

视频1.如何删除甲状腺肿瘤的视频

图1.小鼠甲状腺肿瘤的图片

图2.非粘附细胞群体的相差图像

图3.与粘附群体和小鼠胚胎成纤维细胞相比，非粘附群体高度表达C细胞标记物（A.降钙素，B.Ascl1）

食谱

洗涤缓冲液
2x抗生素
在PBS（pH 7.2）中抗真菌的
消化解决方案
含有300单位/ml胶原酶，100单位/ml透明质酸酶和0.1mg/ml DNase I的DMEM
生长培养基
DMEM，补充10％FBS，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素

致谢

我们感谢S. Kohno，H. Muranaka和Y.Nishimoto帮助准备这份手稿。此外，我们感谢A.伯恩斯的小组激励我们创建这个协议。这项工作得到下一代世界领先研究人员（NEXT）资助计划，科学研究资助（MEXT），阿斯特拉斯代谢疾病研究基金会，武田科学基金会，内藤基金会，第一三共基金会生命科学，NOVARTIS基金会（日本）促进科学和Hokkoku癌症研究基金会。

参考文献

Calbo，J.，van Montfort，E.，Proost，N.，van Drunen，E.，Beverloo，H.B.，Meuwissen，R。和Berns，A。小细胞肺癌小鼠模型中肿瘤细胞异质性的功能作用。 Cancer Cell 19（2）：244-256。
Kitajima，S.，Kohno，S.，Kondoh，A.，Sasaki，N.，Nishimoto，Y.，Li，F.，Abdallah Mohammed，MS，Muranaka，H.，Nagatani，N.，Suzuki， Kido，Y.和Takahashi，C。（2015）。由小鼠甲状腺神经内分泌细胞和胚胎成纤维细胞中Rb-p53双重失活诱导的未分化状态。 Stem Cells 33（5）：1657-1669。
Shamma，A.，Takegami，Y.，Miki，T.，Kitajima，S.，Noda，M.，Obara，T.，Okamoto，T.and Takahashi，C。（2009）。 Rb通过E2F依赖性抑制N-ras异戊二烯化，调节DNA损伤反应和细胞衰老。 a> Cancer Cell 15（4）：255-269
Takahashi，C.，Contreras，B.，Iwanaga，T.，Takegami，Y.，Bakker，A.，Bronson，R.T.，Noda，M.，Loda，M.，Hunt，J.L.and Ewen，M.E。 Nras损失诱导Rb1缺陷的神经内分泌性甲状腺肿瘤的转移性转化。 Genet 38（1）：118-123。