材料和试剂

15和50ml锥形管
培养皿（直径90mm）
pHYG3 质粒（ http://chlamycollection.org/plasmid/phyg3/ ）或携带其他选择标记的质粒
C。例如 dw15 （ cw15 ，nit1，mt ⁺; http://chlamycollection.org/strain/cc-4619-cw15-nit1-mt-dw15- 1/）

琼脂（Caisson Laboratories，Phytoblend）

TAP培养基（Harris，1989）

用于线性化质粒DNA的限制酶，例如PvuII（New England Biolabs）

潮霉素（Life Technologies）或其他选择方式

TAP琼脂平板（见配方）

顶级琼脂（见配方）

设备

普通台式涡流器
用于光密度（OD）测量的分光光度计，Z2 Coulter计数器（Beckman Coulter）或血细胞计数器
250 ml烧瓶
台式离心机，能够以1,500×g离心并容纳50ml锥形管
振动器
Z2 Coulter计数器或血细胞计数器
玻璃珠425-600μm（Sigma-Aldrich，目录号：G8772）
玻璃管或带或不带帽（直径约10 mm）的圆底塑料管

程序

DNA制备（假设使用
pHYG3 ）
1. Digest pHYG3 质粒（ http://www.biologie.uni-regensburg.de/Genetik/Mages/pHyg3.html ）DNA 与PvuII。 PvuII特异性选择pHYG3 质粒，因为它释放含有具有短侧翼序列的潮霉素B抗性基因 aph7 的DNA片段。根据我们的经验和其他，线性DNA通常在进入C细胞后在每端缩短。从几十到几百个核苷酸 - 由于 ?核酸外切酶活性。它使得更难以映射中断的轨迹因为插入的精确顺序是不可预测的在每个克隆中不同。因此，我们建议使用DNA片段刚好足以覆盖选择标记（即启动子，编码）序列和终止子），因此如果转化的DNA被缩短损害标记物，克隆的完整性的程度拥抱他们不会被拉出屏幕。换句话说， ?突变体文库中的克隆具有其长度所在的插入在PvuII消化的片段和启动子的组合长度之间， ?编码序列和终止子
2. 凝胶切除pHYG3 质粒的较短的，2012bp的片段。
成长条件
通常，在22℃下在连续光（70-80μmol/m 2 -2s -1 s -1）下在液体TAP培养基中生长细胞，在100rpm振荡;或用于固体介质的环境室温（?22℃）
玻璃珠转换
1. 在TAP培养基中生长培养物（250ml烧瓶中50ml），直到细胞密度通过Z2 Coulter计数器确定为1-2×10 6个细胞/ml 血细胞计数器，或通过分光光度计约0.2?0.3OD 550
2. 当细胞生长时，准备硬件：向试管中加入?0.3g（?300μl）玻璃珠，高压灭菌
3. 通过离心（1500×g，2分钟）沉淀细胞，并在TAP中重悬至约2×10 7个细胞/ml的浓度。
4. 转移0.3毫升细胞到含玻璃珠的试管，加入 ??1μg以前制备的线性化质粒DNA（参见程序A DNA 准备），并以最高速度涡旋15秒（注2）
5. 加入6ml TAP到试管中，小心地将细胞（6ml + 0.3ml）转移到a 新的无菌15ml锥形管，并在生长条件下摇动过夜（注3），转速为100rpm
6. 过夜回收后，加入6ml ?的顶部琼脂（微波融化顶部琼脂，冷却至?40℃之前倒入过夜培养物）过夜培养物（1：1 混合物）。轻轻混匀。
7. 立即将1：1混合物倒在TAP上板（对于一个常规培养皿为6ml，需要2个培养皿），放置 ?（注4）。
8. 包装有石蜡膜（切割缝隙，允许气体交换），并放置在灯光下。菌落应该开始出现在5 到7天，或者包埋在顶层琼脂层中。一般来说，50ml培养物（步骤C1）大约产生转化后500个菌落。创建一个突变文库整个 C。（约18,000个基因），这将需要 ?100转化以获得3倍覆盖。使用无菌牙签或吸管尖提起殖民地。

笔记

通过玻璃珠的转化仅适用于无细胞壁菌株（例如 dw15 ， cw15 ）（Kindle，1990）。对于细胞壁菌株的转化，更常使用电穿孔（ https：//www。 thermofisher.com/order/catalog/product/A14258 ）。
不要剧烈涡旋细胞，否则DNA片段会破碎，特别是对于更长的片段
如果在过夜振荡期间（方法C，步骤C5）的细胞复制是一个问题（例如，为了避免突变筛选的重复克隆），可以改为8-12小时摇动。
任选：在倾倒1:1混合物之前（步骤C，步骤C7），将琼脂板预温至37℃。

食谱

TAP琼脂平板上 0.8％琼脂与10μg/ml潮霉素
顶部琼脂
含有0.4％琼脂的TAP培养基

致谢

这项工作由美国空军科学研究办公室[批准FA9550-11-1-0264（给C.B.）]，由MSU基金会（向C. B.）和MSU AgBioResearch（C.B。）的战略合作伙伴赠款支持。

参考文献

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