材料和试剂

2ml微量离心管（Fisher Scientific，目录号：05-408-138）
透析管（12-14kDa MWCO）（Spectra/Por，Fisher Scientific，目录号：08-667B）
25mm注射器过滤器（0.45μm）（Sarstedt，目录号：83.1826）
苛刻的Hakea叶或根
具有液体N 2的杜瓦瓶（MVE 20/15）和冰桶
咪唑（Bioshop，目录号：IMID508）
Triton X-100（Bioshop，目录号：TRX777）
甘油（Bioshop，目录号：GLY002）
氯化镁（Bioshop，目录号：MAG508）
聚乙二醇8000（Bioshop，目录号：PEG800）
苯甲基磺酰氟（PMSF，G-Biosciences，目录号：786-0555）
硫脲（Sigma，目录号：T-7875）
聚（乙烯基聚吡咯烷酮）（PVPP，Sigma-Aldrich，目录号：P-6755）
聚（乙烯基吡咯烷酮）（Bioshop，目录号：PVP504）
细胞内提取缓冲液（参见配方）
重悬缓冲液（见配方）
细胞壁提取缓冲液（参见配方）
透析缓冲液（参见配方）

设备

Zeba TM旋转脱盐柱7K MWCO（0.5ml）（Fisher Scientific，目录号：89882）
瓷砂浆（内径70mm）和研钵
塑料颗粒杵（Kimble-Chase Kontes，Fisher Scientific，目录号：K749521-0590）
Advance Centrifugal Concentrators（10kDa MWCO）（Pall Corporation，目录号：MAP010C37）
微量离心机（Beckman Coulter，型号：microfuge 22R）
PT-3100 Polytron均化器（Kinematica，型号：PT-3100）
磁力搅拌器
4°C冷室

程序

该方案适用于从Harsh Hakea叶中提取细胞内和细胞壁蛋白，但也可以应用于根（例如，Shane等人，2014; Shane < em> et al。，2013）。对于优化用于从叶子，茎等提取细胞内和细胞壁蛋白的方案。拟南芥参见Shane等人）; Shane （2013）和Robinson 等人（2012）。

可溶性细胞内蛋白质的提取
1. 快速冷冻新鲜收获的组织在液体N 2。储存于-80℃直至使用。
2. 研磨冷冻组织（例如，?1g，包括生物学重复） ?使用预冷的研钵和研杵将其加入到液体N 2下的粉末中
3. 将等分试样（例如，?200mg）的冷冻组织粉末转移到a 预冷，2ml微量离心管。不要让组织解冻在此步骤。保持样品在液体N 2中直到所有样品称重。
4. 加入冰冷的细胞内提取缓冲液（IEB）以1：4（w/v）的比例加入每个样品并涡旋直到组织融化提取缓冲液。使用Polytron（2至4）简单均质化样品脉冲高速，每脉冲10至15秒），同时保持微量离心管在冰上。在冰上保留匀浆直到全部提取完成（建议不超过8到10 样品/批次以减少蛋白质蛋白水解的可能性等）。
5. 在4℃下以17,500×g离心匀浆15分钟
6. 小心吸取上清（澄清的提取物）和脱盐使用先前在IEB中平衡的Zeba ^TM自旋脱盐柱缺乏PVPP和PVP。脱盐的提取物称为可溶性蛋白质的细胞内部分（例如?2-10mg蛋白质/ml）取决于组织类型和发育阶段）。
洗涤不溶性小丸
1. 含有不溶性细胞碎片的沉淀物被洗涤两次使用沉淀重悬于1.5-2.0ml重悬浮缓冲液（RB）中杵，和如上所述的离心（弃去上清液）
2. 如上所述，将沉淀物在缺乏RB的条件下洗涤四次 Triton X-100。当完全洗涤时，粒料将近无色。
细胞壁结合蛋白的提取
1. 从洗涤的不溶性小丸中提取细胞壁蛋白使用细胞壁提取缓冲液（CWEB）（参见Recipes）（?2 ml），同时在4℃下搅拌30分钟
2. 将样品离心 ?并使用Macrosep离心浓缩器浓缩 ?0.2ml，产生?2mg/ml的蛋白质浓度[for 分光光度法测定蛋白质浓度见Knowles 和Plaxton（2013）]
3. 通过0.45通过澄清提取物 ?注射器过滤器，然后在4℃下对4L透析过夜透析缓冲液（DB），使用Spectra/Por透析管（12-14kDa MWCO， 25 mm平宽）。
4. 所得样品含有"松散结合"的细胞壁蛋白。
5. 细胞壁对细胞内部分的SDS-PAGE，随后 ?使用抗醛缩酶和抗磷酸烯醇丙酮酸的免疫印迹羧化酶抗体以确认无免疫反应性 ?-40kDa醛缩酶和-100kDa磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽（即细胞质标记蛋白）提取物[具体程序参见Shane等人（2014）]。

食谱

所有缓冲液在前一天新鲜配制并在4℃下储存直至使用，但不进行灭菌。

细胞内提取缓冲液（IEB，保存在冰上）
50mM咪唑-HCl（pH7.0） 0.1％（v/v）Triton X-100 10％（v/v）甘油 10mM硫脲 2mM MgCl 2/
2％（w/v）聚乙二醇8000 1％（w/v）聚乙烯基（聚吡咯烷酮）（PVPP）注意：在提取组织前立即向IEB添加新鲜。
1％（w/v）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）
注意：在提取组织前立即向IEB添加新鲜。
1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）注意：
1. 在提取组织之前，立即向IEB添加新鲜。
2. 准备 ?100mM PMSF储备液，置于-20℃保存; PMSF是在水溶液中不稳定。谨慎处理PMSF作为此蛋白酶抑制剂相当毒。
重悬缓冲液（RB，保存在冰中）
50mM Tris-HCl（pH7.4） 10mM MgCl 2/
1％（v/v）Triton X-100
细胞壁提取缓冲液（CWEB，保存在冰中）
1M NaCl的40mM Tris-HCl（pH7.4）中 10mM MgCl 2/
透析缓冲液（DB，保存在4℃冷室）
40mM Tris-HCl（pH7.4） 10mM MgCl 2/

致谢

这项工作得到澳大利亚研究委员会（授予M.W.S.的授权号DP1092856）以及加拿大自然科学和工程研究理事会和皇后研究教席计划（给W.C.P.）的资助。

参考文献

Knowles，V.和Plaxton，W。（2013）。蛋白质提取，酸性磷酸酶活性测定以及可溶性蛋白质浓度的测定生物方案 3（17）：e889。
Shane，M. W.，Fedosejevs，E.T.和Plaxton，W.C。（2013）。通过体内单泛素化和磷酸化在发育中的相互作用控制anaplerotic phosphoenolpyruvate羧化酶磷酸盐缺乏的刺槐的蛋白质根。植物生理学 161（4）：1634-1644。
Shane，M. W.，Stigter，K.，Fedosejevs，E.T.和Plaxton，W.C。（2014）。衰老诱导型细胞壁和细胞内紫色酸性磷酸酶：对于Hakea prostrata中的磷再移植的影响（Proteaceae）和 Arabidopsis thaliana （Brassicaceae）。 65（20）：6097-6106。
Robinson，W.D.，Park，J.，Tran，H.T.，Del Vecchio，H.A.，Ying，S.，Zins，J.L.，Patel，K.，McKnight，T.D.and Plaxton，分泌的紫色酸性磷酸酶同功酶AtPAP12和AtPAP26在胞外磷酸盐清除中起着关键作用> Arabidopsis thaliana 63（18）：6531-6542。