材料和试剂

Sephadex G-25柱（PD-10）（GE Healthcare，目录号：17-0851-01）
4毫升（Bio-Vials）（Beckman Coulter，目录号：566353）的快速盖塑料管和管架
实验室膜（Parafilm M）（Thomas Scientific，Pechiney Plastic Packaging，目录号：PM-996）
含有Rubisco的莱茵衣藻细胞提取物
三[2-氨基-2-羟基甲基-1,3-丙二醇]（Trizma碱）（Sigma-Aldrich，目录号：T-1503）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O·6H 2 O）（Merck Millipore Corporation，目录号：1.05833）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Merck Millipore Corporation，目录号：1.06329）
D-核酮糖1,5-二磷酸钠盐水合物（Sigma-Aldrich，目录号：R-0878）
注意：这表示为钠盐水合物，含有4 Na ⁺ 和3 H _{em> 2} O，总重量为452.1 g/mol。
钠14 C碳酸氢盐（52mCi/mmol）（PerkinElmer，目录号：NEC086H）
2,5-二苯基恶唑（PPO）（Sigma-Aldrich，Fluka，目录号：43140）
1,4-双 - （5-苯基-2-恶唑基）苯（POPOP）（Sigma-Aldrich，Fluka，目录号：15150）
注意：产品15150已停产。
2-苯乙胺（Merck Millipore Corporation，目录号：8.07334）
甲苯（Panreac，目录号：131745-1611）
甲醇（Scharlau S.L.，目录号：ME-0301）
闪烁混合物（Coktail 22 Normascint）（Scharlau S.L.，目录号：CO-0135）
dH 2 O（去离子水）（由来自Merck Millipore Corporation的Milli-Q系统处理）
激活缓冲区（AB）（参见配方）
反应缓冲液（RB）（参见配方）
RuBP储备（见配方）
碱性闪烁鸡尾酒（见配方）
放射性物质（见配方）
2M HCl盐（VWR International，J.T.Baker ，目录号：6081）（参见配方）

设备

配有安全抽气罩的放射性执照实验室
恒温水浴（SBS，型号：TI-03）
秒表计时器（Oregon Scientific Inc.，型号：TR118）
连接到碱性阱的真空烘箱（Thermo Fisher Scientific，Heraeus，型号：Vacutherm VT6025）
放射性闪烁计数器（PerkinElmer，型号：Tri-Carb 2810TR）

程序

激活Rubisco
1. Rubisco从C提取。可以在任何地方测定培养物纯度水平。作为第一步，Rubisco应该转移到 ?含有Mg 2+和溶解的CO 2（作为碳酸氢盐引入）的培养基 ?得到催化活性形式的酶（Laing和Christeller， ?1976）。因此，将起始萃取物脱盐至2.5ml上用激活缓冲液（AB）平衡的Sephadex G-25（PD-10）柱，并用3.5ml相同的缓冲液洗脱注意：本节为相当于"Rubisco的纯化"的方案中的D节 ?衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）"（Sudhani等人，2015），并且可以省略如果Rubisco在纯化后已经转移到AB。
底物混合物和比放射性对照的制备
1. 在安全提取罩中工作，混合1毫升反应缓冲液（RB）， ?0.1ml RuBP储液和15μl放射性储备液放入1.5ml Eppendorf管。这将是底物反应混合物（SR mix）。在 ?平行，制备相同的混合物，但代替0.1ml的RuBP 储备液通过0.1ml dH 2 O。这将是无RuBP反应混合物（NR 混合）。表1总结了两种反应混合物的组成
  表1.反应混合物的组分和体积
  
  反应混合物
  RB
  RuBP股票
  dH 2 2 O 放射性物品
  
  SR mix
  1 ml
  0.1 ml
  0 ml
  15微升
  
  NR mix
  1 ml
  0 ml
  0.1 ml
  15微升
  
  注意：上面给出的体积用于制备1.115ml 混合物，其足以分析约21个小瓶（即一式三份七个独立测定，包括样品和对照）。在用于测定的小瓶数目高于21的情况，卷应相应地按比例放大。
2. 立即放置三个50μl等分的SR混合物和三个50μl等分的NR 混合在用于放射性计数的卡口塑料管（Bio-vial）中。向每个小瓶中加入3ml碱性闪烁剂，混合并计数 ?用于放射性。这些测量是SR和NR控制，和它们将用于确定的确切比放射性固定CO 2。
  注意：商业闪烁鸡尾酒通常是 ?酸性，因此，不能用于这些控制，因为放射性将在气相中丢失，如 ₂ 。
3. 与此同时， ?应保留含有底物混合物的微量离心管在室温下密封至少10分钟以使其通过 14 C碳酸氢盐与非放射性CO 2 2 /碳酸氢盐平衡 ?池。
制备空白，非RuBP固定对照和样品瓶
1. 将开放的小瓶放在样品和其余对照的架子上。的后者包括空白（测量保留在中的放射性缺少样品）和非RuBP固定对照（由于除了Rubisco以外的羧化酶引起的样品的监测潜在CO 2固定）。您可以为每次测定准备三次。
2. 混合180微升的AB和20微升的样品提取物（含有0.2到10微克 ?Rubisco），除了其中加入200μlAB的空白小瓶 ?应交付。将管架浸入恒温水中在30℃在抽提罩内浴中，并静置几分钟 ?以在开始测定之前均化温度注意：代替水浴，管可以替代地放置在罩内的30℃的加热块中。

活动测验

将秒表计时器放在一个方便阅读的地方操作样品，并在时间0通过递送50开始测定 ?μl的放射性SR混合物加入第一管中。随后由 ?每20秒向另外的管中加入50μl。从SR切换到开始时的NR混合物（也提供50微升）样品用于测定非RuBP碳固定。管应该在整个测定中保持在30℃

停止酶反应通过在每个管中恰好5分钟后加入50μl的2M HCl 放射性混合物。表2总结了对的添加到目前为止
表2.在整个测定中添加到每个小瓶中的组分和体积

小瓶类型	AB	解压缩	SR mix	NR mix	2 M HCl
空白	200μl	0微升	50微升	0微升	50微升
No-RuBP（NR）	180微升	20微升	0微升	50微升	50微升
+ RuBP（SR）	180微升	20微升	50微升	0微升	50微升

将样品瓶架（无盖）放在与a连接的真空烘箱中 ?水喷射泵通过碱性阱。这个烤箱也应该放置在安全抽吸罩内。在90°C抽真空总干燥度的管内容物以除去未固定的 ?放射性。这可能需要不到一个小时，但实际持续时间高度取决于泵所达到的真空度
将每个管的干燥内容物再溶解在200μldH 2 O中，并在90℃下再次抽空直至干燥。
再次将每管的干燥内容物再溶解在200μldH 2 O中， ?加入3ml市售闪烁混合物（允许7％水单相）。计数前充分混匀。
计数所有样品在装备有校准的闪烁计数器中效率校正设施。样品瓶应计数长足以累积超过10,000个总计数（例如，如果更多，则为5分钟）检测到2,000cpm）。

评估结果和计算
1. 经闪烁计数器效率校正后，放射性数据将在（或将容易转换成）崩解分钟（dpm）。首先计算一式三份的平均值，从所有其他平均值中减去空白的平均值
2. 一旦 ?空白被扣除，除以平均放射性 SR和NR通过存在于中的CO 2/NaHCO 3的微摩尔数控制 ?反应（0.2ml的10mM碳酸氢盐在AB + 0.05ml的50mM 碳酸氢盐在反应混合物中，其等于4.5μmol）以获得 SR和NR测定的特异性放射性。比放射性应该在2.0 10 ^和之间。 10 ⁵ dpm /μmol。
3. 除以平均值每个样品的放射性（扣除空白）放射性的相应控制得到的数量在每个测定中固定的微摩尔CO 2
4. 从固定在无RuBP测定中的CO 2的微摩尔减去固定在CO 2中的CO 2的微摩尔用RuBP进行相应的测定，得到RuBP的净量 CO ₂固定。
5. 除以固定的CO 2的净微摩尔数 5分钟和0.02ml以获得最终活性（μmolCO 2固定每分钟和ml的酶提取物）。如果Rubisco的浓度测定是已知的，结果可以表示为比活性（例如，每分钟固定的CO 2微摩尔数和mg酶）。典型具体来自野生型菌株的Rubisco的活性。 reinhardtii 约为2 ?μmol的每分钟每mg酶固定的CO 2。

代表数据

表3说明了用数值实施例从原始数据计算酶活性。注意，SR和NR对照的放射性不完全相同，可能是由于在移取小体积的放射性原料时的有限的再现性。这导致在RuBP存在（SR系列）和不存在（NR系列）的测定中略微不同的比放射性。

表3.从实验一式三份测定放射性（dpm）计算Rubisco羧化酶活性

^a 3个副本的平均值
^b平均空白推算（净放射性）的平均值
比放射性（对照的放射性除以4.5μmolCO 2 /碳酸氢盐）
^d CO 固定（净放射性除以相应的比放射性）
^e Net CO <2> 固定，特别是Rubisco（减去NR固定）
^f标准化Rubisco活性=净Rubisco固定除以测定持续时间（5分钟）和提取物体积（0.02ml）

笔记

如果小瓶数量不超过15（通常为5个三次），则该测定可由单个人进行。为了测定更多的小瓶，方便地吸入2人，一次通过每20秒加入底物混合物引发反应，另一次在延迟5分钟后用HCl停止反应。
当测定中等纯化的Rubisco时，RuBP非依赖性固定通常可忽略。因此，可以抑制一组无RuBP小瓶（NR系列），从而大大降低测定时间
真核Rubiscos的碳固定活性在体外测定时（在不存在辅助酶Rubisco活化酶和ATP的情况下）由于RuBP底物阻断无活性形式的催化位点而缓慢衰减，称为"失败"的过程（Edmondson等人，1990）。在 C的情况下，Fallover是可忽略的。用于5分钟固定测定（但其对于延长的孵育将变得越来越明显）。此外，高等植物的Rubiscos经历更强的失败，并且当将该程序适应这些酶时，固定时间应相应地缩短（通常至1分钟）。在任何情况下，当面对来自新物种的Rubisco的测定时，应检查线性的间隔

食谱

活化缓冲液（AB）（100mM Tris-HCl，10mM MgCl 2，10mM NaHCO 3，pH8.2）
对于100 ml：
在约80ml dH 2 SO 4溶液中溶解1.210g Tris和0.203g MgCl 2。 O
使用稀释的（例如，，1M）HCl
将pH调节至8.19 加入0.084g NaHCO 3（先前在铝箔上称重）并溶解。最终的pH值应该非常接近8.2（但不要再调整它）。
使最终体积为100毫升，并转移到一个100毫升的瓶子，留下很少的顶空。在使用前不久制备该缓冲液以防止碳酸氢盐作为CO 2的显着损失。
反应缓冲液（RB）（100mM Tris-HCl，10mM MgCl 2，55mM NaHCO 3，pH8.2）
对于100 ml：
在约80ml的dH 2中溶解1.210g的Tris和0.203g的MgCl 2·6H 2 O·6H 2 O。 O
使用稀释的（例如，，1M）HCl
将pH调节至8.18 加入0.462g NaHCO 3（预先称量在铝箔上）并溶解。最终的pH值应该非常接近8.2（但不要再调整它）。
使最终体积为100 ml
该缓冲液应在用其制备反应混合物之前立即制备
RuBP股票
RuBP是干粉末，但它是非常吸湿，不应称重。因此，一旦打开密封瓶，立即用dH 2 O将原容器内的粉末稀释至10mg/ml浓度（约22mM），根据制造商声明的量。您可以通过比较填充和空（干燥）容器的重量，然后根据需要重新调整标称浓度来验证实际量。
等分RuBP溶液150μl，并在液氮中冷冻。将等分试样储存在-80℃，并在制备反应混合物之前立即解冻，以使糖的自发氧化最小化，这导致抑制Rubisco活性的杂质（Kane等人，，1998）。
碱性闪烁鸡尾酒
对于115毫升：
将0.980g PPO和0.020g POPOP溶于57ml甲苯中加入50ml 2-苯乙胺并混合
加入3ml甲醇和5ml dH 2 O 2 / 最终混合物应保持为单相。
储存在4°C避光
放射性物品
14 C-碳酸氢盐通常由制造商在密封的玻璃安瓿内在高pH（例如9.5）下作为水溶液递送。一旦打开，剩余的溶液应该被转移到容器内，留下很少的顶部空间（例如足够体积的Eppendorf管），并且紧密封闭（例如包裹在几层石蜡膜）在室温下在安全罩内。但是与大气CO 2存在一些不可避免的交换，导致比放射性的非常缓慢的下降。这就是为什么应该测量每次测定的实际比放射性的原因
2 M HCl
对于10ml：
将2ml浓缩的（36-38％，约10M）HCl与8ml dH 2 O混合。

致谢

这项工作是由瓦伦西亚大学的赠款（UV-INV-AE14-269247）支持的。

参考文献

Edmondson，D.L.，Badger，M.R。和Andrews，T.J。（1990）。催化期间核酮糖二磷酸羧化酶的缓慢失活是由缓慢，紧密结合的抑制剂在催化位点。植物生理学 93（4）：1390-1397
Kane，H.J.，Wilkin，J.M.，Portis，A.R.and John Andrews，T。（1998）。通过核酮糖-1,5-二磷酸中的氧化杂质有效抑制核酮糖 - 二磷酸羧化酶。/a> Plant Physiol 117（3）：1059-1069。
Laing，W.A。和Christeller，J.T。（1976）。核酮糖1,5-二磷酸羧化酶的活化和催化动力学模型。 Biochem J 159（3）：563-570。
Lilley，R.M。和Walker，D.A。（1974）。改进的核酮糖二磷酸羧化酶的分光光度测定法。生物化学生物物理学> 358（1）：226-229。
Lorimer，G.H.，Badger，M.R。和Andrews，T.J。（1977）。 D-核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶 - 加氧酶。改进的用于活化和测定催化活性的方法。 Anal Biochem 78（1）：66-75。
Sudhani，H.P.K.，García-Murria，M.J.，Marín-Navarro，J.，García-Ferris，C.，Pe?arrubia，L.and Moreno，J.（2015）。从莱茵衣藻中纯化Rubisco 生物协议 5（23）：e1673。